Fourier-Based diffractie analyse van levende Caenorhabditis elegans
Summary
Dit manuscript wordt beschreven hoe onderscheiden verschillende nematoden ver-veld diffractie handtekeningen gebruiken. We vergelijken de motoriek van 139 wild type en 108 “Roller” C. elegans door gemiddeld frequenties de temporele Fraunhofer diffractie handtekening op een enkele plaats met behulp van een continu wave laser is gekoppeld.
Abstract
Dit manuscript wordt beschreven hoe classificeren nematoden temporele ver-veld diffractie handtekeningen gebruiken. Een enkele C. elegans is opgeschort in een waterkolom binnen een optische cuvette. Een 632 nm continuous wave HeNe laser is geregisseerd door middel van de Cuvet met behulp van front oppervlakte spiegels. Een aanzienlijke afstand van ten minste 20-30 cm reisde nadat het licht de cuvette passeert zorgt voor een nuttige ver-veld (Fraunhofer) diffractie patroon. De diffractie patroon veranderingen in real time de nematode zwemt binnen de laserstraal. De fotodiode is uit het midden geplaatst in het patroon van diffractie. Het signaal van de spanning van de fotodiode is waargenomen in real-time en opgenomen met behulp van een digitale oscilloscoop. Dit proces wordt herhaald voor 139 wild type en 108 “roller” C. elegans. Wild type wormen vertonen een snelle oscillatie patroon in oplossing. De “roller” wormen hebben een mutatie in een essentieel onderdeel van de epidermis die met smooth locomotion interfereert. Tijdsintervallen die niet vrij van verzadiging en inactiviteit zijn verwijderd. Het is praktisch elke gemiddelde delen door het maximum te vergelijken van de relatieve intensiteiten. Het signaal voor elke worm is dat Fourier omgezet, zodat het patroon van de frequentie voor elke worm naar voren komt. Het signaal voor elk type van worm is gemiddeld. De gemiddelde Fourier spectra voor het wild type en de “roller” C. elegans zijn duidelijk verschillend en onthullen dat de shapes dynamische worm van de twee verschillende worm stammen kunnen worden onderscheiden met behulp van Fourier-analyse. De Fourier-spectra van elke stam worm overeenkomen met een geschatte model met behulp van twee verschillende binaire worm shapes die met motorische momenten corresponderen. De envelop van de gemiddelde verdeling van de frequentie voor werkelijke en gemodelleerd wormen bevestigt het model komt overeen met de gegevens. Deze methode kan dienen als een basislijn voor Fourier-analyse voor vele microscopische soorten, aangezien elk micro-organisme zijn unieke Fourier-spectrum zal hebben.
Introduction
Deze methode vergelijkt experimentele en gemodelleerd frequentie spectra van de motoriek van C. elegans met behulp van twee stammen met zeer verschillende motorische patronen. De resultaten tonen aan dat het frequentiespectrum afhankelijk van temporele veranderingen zoals de nematode in een waterkolom zwemt zodat duidelijke microscopische afbeeldingen niet nodig zijn voor de analyse. Deze methode zorgt voor kwantitatieve real-time analyse en aanvullende informatie verkregen met traditionele microscopen afbeeldingen/video’s. Fraunhofer diffractie, ook wel ver-veld diffractie, vormt de basis voor het verkrijgen van levende diffractie gegevens1,2. De lichtintensiteit op enkel punt in de diffractie-patroon is het resultaat van het licht vanuit elk punt in de omtrek van de nematode3boven elkaar plaatsen. Dientengevolge, draagt de lichtintensiteit verzameld na verloop van tijd informatie over de motoriek van het dennenaaltje. Analyseren van het signaal van de tijd-afhankelijke diffractie herkent de karakteristieke motie van de overeenkomstige mutant aangezien analyseren van alle frequenties die betrokken zijn in de motoriek is een aanvulling op de traditionele video-analyse. In dit geval zijn de kenmerkende verschillen tussen de motoriek van het “roller” en wilde type C. elegans bevestigd door het vergelijken van de spectra van de frequentie van de twee verschillende stammen van nematode.
Sommige eerdere kenmerken zijn bevestigd met behulp van de frequentie-analyse van diffractie signalen zoals zwemmen frequenties2,4. Wat nog belangrijker is, kan deze methode worden gebruikt als een aanvullende methode om traditionele microscopie te observeren motoriek in real time op het computerscherm van een als de gegevens worden verzameld. Het frequentiespectrum van wormen met verschillende motorische patronen kan worden gekwantificeerd door te overwegen dat de Fourier getransformeerd signaal van het signaal van diffractie.
Het multidisciplinaire karakter van Fourier gebaseerde diffractie in dit werk omvat het gebied van biologie en natuurkunde. Diffractie door onder bemonstering heeft lange tijd gebruikt om kristalstructuren in biologie5 en andere gebieden te onderzoeken. In dit experiment echter maakt oversampling6,7 het ver-veld diffractie patroon zodat het organisme wordt gecentreerd in de laserstraal. Oversampling wordt meestal gebruikt voor lens-minder imaging8 in combinatie met een algoritme voor het ophalen van fase dat Hiermee reconstrueert u een afbeelding van het oorspronkelijke object. Fase ophalen is moeilijk te bereiken als er scatterers aanwezig zijn, zoals het geval met een nematode. De temporele diffractie handtekening volstaat om te evalueren van de belangrijkste frequenties van de beweging van de worm. Deze methode is minder computationeel belasten en biedt een optische manier te kwantificeren van de motoriek. Deze techniek kan gemakkelijk worden aangepast voor analyse van mutaties of milieuomstandigheden die gedrag aanpassen.
Protocol
Representative Results
Discussion
Met inbegrip van stukken van gegevens met inactiviteit zal vertekenen de resultaten aangezien kunstmatige lagere frequenties zal worden gemiddeld in de resultaten. Verzadigen van de fotodiode kan worden herkend door de vlakke toppen of “afgesneden” pieken in de ruwe gegevens. Elke ruwe data set te delen door de piek intensiteit zal helpen met de boekhouding voor schommelingen in de intensiteit van de laser.
De frequenties van de piek zijn een indicatie van de totale dorsen frequentie; echter ingewikkeld beweging veroorzaakt storingen bij beat frequenties in het patroon diffractie en moeten zorgvuldig worden onderzocht.
Deze methode kan worden gebruikt om te onderzoeken van de motoriek van andere nematoden. Het milieu kan worden gewijzigd in een ander medium. Golflengten kunnen ook worden gewijzigd. Werken in het zichtbare bereik van het elektromagnetische spectrum is de gemakkelijkste en veiligste.
Een meer verfijnde model zal in de toekomst realistischer de diffractie spectra simuleren. Een toekomstig model bevatten een worm die richtsnoeren, die zou geen invloed op de frequentie locaties maar relatieve piekhoogten kunt wijzigen. Een meer realistische model zou voor een probabilistische verdeling van pak slaag frequenties, die zou het verbreden van de pieken in de experimentele gegevens. Een spreiding in frequenties zou meetvariaties te geselen frequenties.
De huidige vorm van de worm is ruw, vooral in de regio kop en staart, die meer taps toelopende dan in het huidige model moet. Het wellicht interessant om uit te voeren van een gedetailleerde analyse van de tijdreeks van het signaal omdat het zou kunnen aanwijzingen over de complexiteit van het voortbewegen in verschillende mutanten geven.
Het is de uitvoerbaarheid van uitbreiding van deze techniek in de karakterisering van meerdere nematoden gelijktijdig overwegen waard. Deze methode moet worden opgevat als een aanvullende methode om bestaande methoden met behulp van traditionele microscopen. Deze methode heeft een voordeel niet verplichten een Microscoop tijdens de data-acquisitie zodat de worm uit het brandvlak kan verplaatsen. De gemiddelde frequentie spectra vertonen duidelijke verschillen in worm beweging en kunnen worden gekwantificeerd door de toppen van de voorkomende frequentie, die een nieuwe methode in het kwantificeren van de motoriek van de worm. Data-analyse van de diffractie handtekeningen is in de verdere ontwikkeling en hopelijk zal leiden tot een geautomatiseerde identificatieproces van meerdere mutanten en individuen.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Wij danken Juan Vasquez voor zijn computationele bijdragen met dit project. We zijn dankbaar voor de steun van de Vassar College Undergraduate Research zomer Instituut (URSI), het onderzoeksfonds voor Lucy Maynard zalm en de NSF award nr. 1058385.
Materials
| Tunable Helium-Neon laser | Research Electro-Optics | 30602 | Four wavelengths can be selected between 543 nm and 633 nm. |
| 2 Front Surface Aluminum Mirrors | Thorlabs | PF10-03-F01 | |
| Photodiode: SI Amplified Detector | Thorlabs | PDA 100A | |
| Quartz Cuvette | Starna Cells | 21/G/5 | Plastic cells may be used as well. |
| MatLab (Software) | MathWorks | R2016b (9.1.0.441655) | Use the fft command to simulate diffraction |
| Excel | Microsoft | 14.7.1 | Used for data analysis of Fig. 4 |
| Caenorhabditis elegans Roller | University of Minnesota Caenorhabditis elegans Center (CGC) | Strain: OH7547 Genotype: otIs199. |
https://cbs.umn.edu/cgc/home |
| Caenorhabditis elegans Wild Type | University of Minnesota Caenorhabditis elegans Center (CGC) | Strain:N2 Genotype: C. elegans wild isolate | https://cbs.umn.edu/cgc/home |
References
- Magnes, J., et al. Analysis of Freely Swimming C. elegans Using Laser Diffraction. Open J. Biophys. 2, 101-107 (2012).
- Magnes, J., Raley-Susman, K. M., Eells, R. Quantitative Locomotion Study of Freely Swimming Micro-organisms Using Laser Diffraction. J. Vis. Exp. (68), (2012).
- James, J. F. . A Student’s Guide to Fourier Transforms with Applications in Physics and Engineering. , (1995).
- Korta, J., Clark, D. A., Gabel, C. V., Mahadevan, L., Samuel, A. D. T. Mechanosensation and mechanical load modulate the locomotory gait of swimming C. elegans. J. Exp. Biol. 210, (2007).
- Martin-Garcia, J. M., Conrad, C. E., Coe, J., Roy-Chowdhury, S., Fromme, P. Serial femtosecond crystallography: A revolution in structural biology. Arch. Biochem. Biophys. 602, 32-47 (2016).
- Thibault, P., Rankenburg, I. C. Optical diffraction microscopy in a teaching laboratory. Amer. J. Phys. 75 (9), 827-832 (2007).
- Miao, J., Ishikawa, T., Anderson, E. H., Hodgson, K. O. Phase retrieval of diffraction patterns from non crystalline samples using the oversampling method. Phys. Rev. B. 67, 174104 (2003).
- Zhang, Y. P., Zhang, J. Q., Xu, W. Method for eliminating zero-order diffraction in lensless Fourier transform digital holography. Optik – International Journal for Light and Electron Optics. 124 (21), 4873-4875 (2013).
- Brody, A. H., Chou, E., Gray, J. M., Pokrywka, N. J., Raley-Susman, K. M. Mancozeb-induced behavioral deficits precede structural neural degeneration. NeuroToxicology. 34, 74-81 (2013).
- Stiernagle, T. Maintenance of C. elegans. WormBook. , (2006).
- Dasalukunte, D., Öwall, V., Rusek, F., Anderson, J. B. . Faster than Nyquist Signaling. Algorithms to Silicon. , (2014).
- Edwards, S. L., et al. A novel molecular solution for ultraviolet light detection in Caenorhabditis elegans. PLoS Biol. 6 (8), e198 (2008).
- Bilbao, A., Wajnryb, E., Vanapalli, S. A., Blawzdziewicz, J. Nematode Locomotion in Confined and Unconfined Fluids. Phys. Fluids. 25, 081902 (2013).
