Basado en la transformada de Fourier Análisis difracción de vivir Caenorhabditis elegans
Summary
Este manuscrito describe cómo distinguir diferentes nematodos utilizando firmas de difracción del campo lejano. Comparamos la locomoción de 139 tipo salvaje y 108 “Roller” C. elegans promediando las frecuencias asociadas con la firma de difracción de Fraunhofer temporal en un solo lugar usando un láser de onda continua.
Abstract
Este manuscrito describe cómo clasificar nematodos usando firmas temporal difracción del campo lejano. Una sola C. elegans se suspende en una columna de agua dentro de una cubeta óptica. Un láser de HeNe onda continua 632 nm se dirige a través de la cubeta utilizando espejos de superficie frontales. Una gran distancia de por lo menos 20-30 cm viajado después la luz pasa a través de la cubeta asegura un patrón de difracción útil de campo lejano (Fraunhofer). Los cambios del patrón de difracción en tiempo real como el nematodo nada dentro del rayo láser. El fotodiodo se coloca fuera del centro en el patrón de difracción. La señal de voltaje desde el fotodiodo se observa en tiempo real y grabado con un osciloscopio digital. Este proceso se repite para 139 tipo de salvaje y 108 “rodillo” de C. elegans. Tipo salvaje gusanos exhiben un patrón de oscilación rápida en solución. Los gusanos “roller” tienen una mutación en un componente clave de la cutícula que interfiere con la locomoción suave. Intervalos de tiempo que no están libres de saturación y la inactividad son descartados. Es práctico dividir cada media por su máximo comparar intensidades relativas. La señal de cada gusano es para que el patrón de frecuencia para cada gusano emerge de la transformada de Fourier. Es un promedio de la señal para cada tipo de gusano. Los espectros de Fourier promedio para el tipo salvaje y el “rodillo” C. elegans son claramente diferentes y revelan que las formas de gusano dinámico de las dos cepas diferentes del gusano se pueden distinguir mediante el análisis de Fourier. Los espectros de Fourier de cada cepa de gusano coincide con un modelo aproximado usando dos formas de gusano binarios diferentes que corresponden a momentos de locomoción. La envolvente de la distribución de frecuencia media para gusanos reales y modelados confirma el modelo coincide con los datos. Este método puede servir como base para el análisis de Fourier para muchas especies microscópicas, como cada microorganismo tiene su espectro de Fourier único.
Introduction
Este método compara espectros de frecuencia experimental y modelado de la locomoción de C. elegans con dos variedades muy diferentes patrones de locomoción. Los resultados muestran que el espectro de frecuencia depende de cambios temporales como el nematodo de la nada en una columna de agua para que imágenes microscópicas claro no son necesarios para el análisis. Este método permite el análisis cuantitativo en tiempo real y proporciona información complementaria a imágenes y vídeos obtenidos con los microscopios tradicionales. Difracción de Fraunhofer, llamado también difracción del campo lejano, proporciona la base para la obtención de datos de difracción en1,2. La intensidad de la luz en cualquier punto en el patrón de difracción es el resultado de la superposición de luz desde todos los puntos del contorno de los nematodos3. Como resultado, la intensidad de la luz más tiempo lleva información sobre la locomoción de los nematodos. Análisis de la señal dependiente del tiempo de difracción pueden identificar el movimiento característico del mutante correspondiente puesto que analizar todas las frecuencias que intervienen en la locomoción complementa el tradicional análisis de vídeo. En este caso, las diferencias características entre la locomoción del “rodillo” y tipo salvaje C. elegans se confirman mediante la comparación de los espectros de frecuencia de las dos cepas diferentes de nematodos.
Algunas de las características anteriores han sido confirmados mediante el análisis de frecuencia de las señales de difracción como natación de2,de frecuencias4. Más importante aún, este método puede utilizarse como un método complementario a la microscopía tradicional para locomoción en tiempo real en una pantalla de ordenador, observando los datos se están recopilando. El espectro de frecuencia de gusanos con diferentes patrones de locomoción puede cuantificarse teniendo en cuenta que el Fourier transforma la señal de la señal de difracción.
El carácter multidisciplinar de la difracción basada en la transformada de Fourier en este trabajo consiste en los campos de la biología y la física. Difracción por debajo de muestreo ha sido utilizada para investigar las estructuras cristalinas en biología5 y otros campos. En este experimento, sin embargo, oversampling6,7 crea el patrón de difracción del campo lejano para que el organismo se centra en el rayo láser. Sobremuestreo se utiliza normalmente para la proyección de imagen de lente menos8 junto con un algoritmo de recuperación de fase que reconstruye una imagen del objeto original. Fase de recuperación es difícil de lograr cuando los difusores están presentes como es el caso de un nematodo. La firma de difracción temporal es suficiente para evaluar las frecuencias fundamentales del movimiento del gusano. Este método es menos cómputo gravar y proporciona una forma óptica para cuantificar la locomoción. Esta técnica podría ser fácilmente adaptada para el análisis de las mutaciones o las condiciones ambientales que alteran el comportamiento.
Protocol
Representative Results
Discussion
Con tramos de datos de inactividad se sesgan los resultados desde frecuencias bajas artificiales se promediaron los resultados. Saturar el fotodiodo puede ser reconocido por planos cumbres o picos de “corte” en los datos en bruto. Dividiendo cada conjunto de datos de raw de intensidades de pico ayuda a contabilidad las fluctuaciones en la intensidad del láser.
Las frecuencias de pico son un indicador de la general golpear frecuencia; sin embargo, complicado el movimiento causa interferencia a frecuencias beats en el patrón de difracción y deben ser examinados cuidadosamente.
Este método puede utilizarse para investigar la locomoción de otros nematodos. El medio ambiente se puede cambiar a otro medio. Se pueden cambiar las longitudes de onda. Trabajando en la gama visible del espectro electromagnético es más fácil y más segura.
Un modelo más refinado simulará los espectros de difracción más realista en el futuro. Un futuro modelo puede incluir un gusano que puede cambiar orientaciones, que no afectaría a localizaciones de frecuencia pero alturas máxima relativa. Un modelo más realista permitiría una distribución probabilística de las frecuencias de la paliza, que ampliaría los picos como en los datos experimentales. Las variaciones en las frecuencias de golpear representaría una propagación en frecuencias.
La actual forma de gusano es cruda, especialmente en la región de cabeza y la cola, que debería ser más afilada que en el modelo actual. Puede ser interesante realizar un análisis detallado de la serie de tiempo de la señal ya que podría dar pistas sobre la complejidad de la locomoción en mutantes diferentes.
Merece la pena teniendo en cuenta la practicidad de la expansión de esta técnica en caracterización de nematodos múltiples simultáneamente. Este método debe ser entendido como un método complementario a los métodos existentes usando los microscopios tradicionales. Este método tiene la ventaja de no requerir un microscopio durante la adquisición de datos para que el gusano puede moverse fuera del plano focal. Los espectros de frecuencia promedio muestran claras diferencias en el movimiento del gusano y pueden ser cuantificados por los picos de frecuencia prevalecen, que es un método novedoso en la cuantificación de locomoción de gusano. Análisis de los datos de las firmas de la difracción es en el desarrollo y que dará lugar a un proceso de identificación automatizada de múltiples mutantes y de los individuos.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Agradecemos a Juan Vásquez por sus contribuciones computacionales con este proyecto. Estamos agradecidos por el apoyo de la Vassar College licenciatura investigación verano Instituto (URSI), el fondo de investigación de salmón de Maynard de Lucy y la NSF award no. 1058385.
Materials
| Tunable Helium-Neon laser | Research Electro-Optics | 30602 | Four wavelengths can be selected between 543 nm and 633 nm. |
| 2 Front Surface Aluminum Mirrors | Thorlabs | PF10-03-F01 | |
| Photodiode: SI Amplified Detector | Thorlabs | PDA 100A | |
| Quartz Cuvette | Starna Cells | 21/G/5 | Plastic cells may be used as well. |
| MatLab (Software) | MathWorks | R2016b (9.1.0.441655) | Use the fft command to simulate diffraction |
| Excel | Microsoft | 14.7.1 | Used for data analysis of Fig. 4 |
| Caenorhabditis elegans Roller | University of Minnesota Caenorhabditis elegans Center (CGC) | Strain: OH7547 Genotype: otIs199. |
https://cbs.umn.edu/cgc/home |
| Caenorhabditis elegans Wild Type | University of Minnesota Caenorhabditis elegans Center (CGC) | Strain:N2 Genotype: C. elegans wild isolate | https://cbs.umn.edu/cgc/home |
References
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