JoVE Journal > Immunology and Infection
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Results
Discussion
Disclosures
Acknowledgements
Materials
References
العربية

Automatically Generated
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Immunology and Infection

حبة على أساس مقايسة متعدد لتحليل الملامح سيتوكين المسيل للدموع

Published: October 13, 2017
doi:
10.3791/55993
, , , , , ,
1National Healthcare Group Eye Institute,Tan Tock Seng Hospital, 2Singapore Eye Research Institute (SERI), 3Institute of Molecular and Cell Biology,A*STAR, 4GROW Research Laboratory,Narayana Nethralaya Foundation, 5Vimta Labs Limited

Summary

ويساعد تحليل السيتوكينات الفيلم المسيل للدموع في دراسة أمراض العين المختلفة. حبة على أساس متعدد فحوصات بسيطة وحساسة وتمكين اختبار أهداف متعددة في العينات بكميات صغيرة. هنا يمكننا وصف بروتوكول للمسيل للدموع الفيلم سيتوكين التنميط باستخدام حبة على أساس مقايسة متعدد.

Abstract

الفيلم المسيل للدموع هو خليط معقد من الدهون والبروتينات والمعادن الذي يغطي السطح الخارجي للعين، وبالتالي توفير تزييت والتغذية والحماية للخلايا الأساسية. تحليل للدموع مجالاً ناشئاً للتعرف على المؤشرات الحيوية للتنبؤ، والتشخيص، والتشخيص لأمراض العين المختلفة. دموع يمكن الوصول إليها بسهولة وجمعها غير الغازية. ولذلك، تكتسب التكنولوجيات المتقدمة مكانة بارزة للتعرف على تحليلها متعددة في البكاء لدراسة التغيرات في تركيبة البروتين أو المستقلب وارتباطها بالحالات المرضية. السيتوكينات المسيل للدموع هي المؤشرات الحيوية مثالية لدراسة صحة سطح العين، ويساعد أيضا في فهم آليات مختلفة اضطرابات سطح العين مثل مرض جفاف العين والتهاب الملتحمة ربيعي. حبة على أساس متعدد فحوصات لديها القدرة على الكشف عن تحليلها متعددة في كمية صغيرة من العينة مع حساسية أعلى. هنا يمكننا وصف بروتوكول موحد لجمع العينات المسيل للدموع، واستخراج وتحليل التنميط سيتوكين استخدام حبة على أساس مقايسة متعدد.

Introduction

الدموع تنتجها الغدة الدمعية والغدد الملحقة ومعطف على السطح الخارجي للعين. فيلم المسيل للدموع ويتكون من طبقة دهن خارجي وطبقة مائية داخلية يتضمن البروتينات القابلة للذوبان، موكنيس والغشاء ملزمة موكنيس. دموع منع الغزو الميكروبي وتوريد المواد الغذائية وتوفير تزييت لسطح العين. دموع العمل كوسيط بين الهواء والأنسجة لنقل الأوكسجين إلى القرنية. تتكون من البروتينات والكربوهيدرات والدهون والأملاح 1 الفيلم المسيل للدموع. الرابطة بين البروتينات المسيل للدموع بأمراض العين والجهازية مثل الزرق، مرض جفاف العين، التهاب الملتحمة ربيعي، ومرض البول السكري، تم التعرف على أوربيتوباثي المرتبطة بالغدة الدرقية، وسرطان في العديد من الدراسات. 2 , 3 , 4 ويمكن جمع عينات المسيل للدموع بأنابيب ميكروكابيلاري أو شرائط تدفق المسيل للدموع (شرائط شيرمر). بالإضافة إلى ذلك، هو اختبار شيرمر إجراء قياسية المنجز في القرنية وعيادات الجراحة الانكسارية، النتائج التي قد تستعمل لفحوصات التحليل سيتوكين. جمع العينات عدم الغازية، إمكانية الحصول على بيو-العينة، والرابطة لتكوين المسيل للدموع مع مختلف الظروف الفسيولوجية والمرضية تجعل الدموع الفيلم مصدرا محتملاً للمؤشرات الحيوية لعدة أمراض العين والجهازية. 4 , 5 , 6

المسيل للدموع السيتوكينات دوراً هاما في دراسة الصحة سطح العين والظروف الملتهبة من أمراض العين المختلفة. 7 أبلغ عن تركيزات غير طبيعية من السيتوكينات عدة في عينات المسيل للدموع مرتبطة بمرض العين الجافة ورمد ربيعي (فكك) ورمد التاتبيه (AKC)، والتهاب الملتحمة التحسسي الموسمي والتهاب القزحية. 8 , 9 , 10 , 11 , 12 , 13 يمكن أن تحلل البروتينات المسيل للدموع بالطرق التقليدية مثل الطيف الكتلي، النشاف الغربية وفحوصات الممتز المرتبط بالانزيم (ELISA). 14 , 15 ولكن القيود المفروضة على هذه الأساليب هي حساسية الفقراء وحجم أكبر من العينة المطلوبة لتحليل متعددة السيتوكينات المسيل للدموع في كل مريض. 16 , 17 حبة على أساس متعدد فحوصات أعدت لتحليل التحاليل متعددة في عينات خليط معقد وتطبيقها بنجاح على عينات المسيل للدموع لتحليل السيتوكينات متعددة في مختلف الأمراض. 6 , 18 ألف الجمع بين ساندويتش أليسا وتقنيات قياس التدفق تمكين هذه فحوصات لتصبح أكثر حساسية من أليسا للتحديد الكمي لتحليلها متعددة في نموذج واحد. 19 ويمكن تطبيق هذا الأسلوب على مجموعة متنوعة من العينات السريرية و supernatants ثقافة الخلية ويساعد في دراسة الاستجابات المناعية في العديد من الشروط الفيزيولوجية المرضية. 20 , 21 , 22 , 23 , 24

وهناك عدة دراسات مقارنة حبة على أساس متعدد فحوصات مع أليسا وأبلغت عن وجود ارتباط بين الأساليب. حبة et al. ، مقارنة مع الحمام على أساس مقايسة متعدد مع أليسا التقليدية للكشف عن الاديبونكتين، ريسيستين، اللبتين وجريلين في عينات المصل أو البلازما البشرية وذكرت علاقة قوية (r > 0.9) بين فحوصات. 25 دوبون وآخرون عن ارتباط قوي بين حبة على أساس متعدد فحوصات وإليزا للكشف عن إيل-1β، إيل-4، وايل-5، وايل-6، إيل-10، إيفن-ϒ، وتنف-α في فيتوهيماجلوتينين وليبوبوليساكتشاريدي وحفز كل الدم جمع من النساء الحوامل. 26 بيكرينغ وآخرون عن آخر علاقة قوية بين حبة على أساس متعدد المقايسة وإليزا للكشف عن أضداد المصل النزلة بنوع السكاريد (r = 0.96)، toxoids الكزازيه clostridium (r = 0.96)، و وتدية خناقية (r = 0.91). 27 بياجيني وآخرون عن ارتباط إيجابي عالية (r = 0.852) بين حبة على أساس متعدد المقايسة وإليزا للكشف عن عصيات الجمرة الخبيثة المضادة-PA مفتش في عينات مصل الدم. 28 وانغ وآخرون عن ارتباط بين حبة على أساس متعدد المقايسة وإليزا للكشف عن مرض الزهايمر المؤشرات الحيوية اميلويد بيتا 42 (r = 0.77)، مجموع تاو (r = 0.94)، وتأو فوسفوريلاتيد في الحمض الأميني 181 (r = 0.82) في عينات السائل الدماغي النخاعي. 29 هذه الدراسات قد أظهرت مدى انطباق حبة استناداً إلى فحوصات متعدد متنوعة من العينات السريرية ومتطلبات حجم عينة أصغر وارتباط مع أليسا القياسية، التي تجعل حبة على أساس متعدد فحوصات مبشرة بالخير بديل للطرق التقليدية إليزا للكشف عن تحليلها متعددة في نوع مختلف من العينات في أمراض مختلفة تعمل. هنا يمكننا وصف بروتوكول موحد للمقايسة حبة على أساس متعدد سيتوكين التنميط لتحليلها 41 في المسيل للدموع عينات جمعت من الأصحاء باستخدام شرائط شيرمر.

Protocol

البروتوكولات المستخدمة في هذه الدراسة وقد أقرها المجلس الاستعراض المؤسسي مستشفى تان توك سنج، سنغافورة- 1-تحليل سيتوكين “المسيل للدموع” جمع الدموع: طرح هذا الموضوع الجلوس بشكل مريح على كرسي فحص ووضع رأسه صفحته/صفحتها ضد مسند الرأس. طرح هذا الموضوع ا?…

Representative Results

تم جمع عينات المسيل للدموع من أعين 8 من 4 مواضيع صحية باستخدام شرائط تدفق المسيل للدموع وحللت سيتوكين مستويات استخدام البروتوكول المشار إليه أعلاه. جميع المواضيع كانت الذكور وسن المواضيع الأربعة أعوام 36، 42 و 44 و 52 على التوالي. الصحة سطح العين والعين الجافة تم تقييم المرض ب…

Discussion

السيتوكينات هي البروتينات يفرزها الخلوية الصغيرة والمغيرون محصنة قوية تنظم الاستجابات المناعية. 32 ملامح التعبير السيتوكينات المختلفة في المسيل للعينات المرتبطة بمختلف الحالات المرضية للعين ودراسات عن سيتوكين التشكيلات الجانبية لتساعد على فهم آليات إمراضية المرض، وتحديد …

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

أعمال البحث التي تدعمها “منحة المركز” من تان توك سنج مستشفى شخصية بذرة تمويل البرنامج عام 2015؛ منح سنغافورة العين بحوث المعهد الطيار غرانت وتأن توك سنج مستشفى الملعب للصندوق.

Materials

Milliplex MAP human cytokine / chemokine magnetic bead panel -1 kit Merck, USA HCYTOMAG-60K-41
Flexmap 3D luminex instrument  Luminex Corp, Austin, TX, USA
xPonent software  Luminex Corp, Austin, TX, USA
RBXGenerator software BIO-RAD, France
Bio-Plex Manager 6.1 BIO-RAD, France
Plate shaker Corning, USA
TECAN Microplate Washer Tecan, Switzerland HydroSpeed
Vortex Genie 2 Scientific Industries inc, USA G560E
Pipettes Mettler Toledo, CA, USA
1.5ml microcentrifuge tube Axygen, USA MCT-150-C
Schirmer tear flow test strip Eye Care and Cure, USA 101657
Flexmap 3D Calibration Kit Luminex Corp, Austin, TX, USA 40-028
Flexmap 3D Verfication Kit Luminex Corp, Austin, TX, USA 40-029
Ocular examination chair
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Conrady, C. D., Joos, Z. P., Patel, B. C. Review: The Lacrimal Gland and Its Role in Dry Eye. J Ophthalmol. 7542929, (2016).
  2. von Thun Und Hohenstein-Blaul, N., Funke, S., Grus, F. H. Tears as a source of biomarkers for ocular and systemic diseases. Exp Eye Res. , 126-137 (2013).
  3. Pieragostino, D., D’Alessandro, M., di Ioia, M., Di Ilio, C., Sacchetta, P., Del Boccio, P. Unraveling the molecular repertoire of tears as a source of biomarkers: beyond ocular diseases. Proteomics Clin Appl. 9 (1-2), 169-186 (2015).
  4. Azkargorta, M., Soria, J., Acera, A., Iloro, I., Elortza, F. Human tear proteomics and peptidomics in ophthalmology: Toward the translation of proteomic biomarkers into clinical practice. J Proteomics. 150, 359-367 (2017).
  5. Hagan, S., Martin, E., Enríquez-de-Salamanca, A. Tear fluid biomarkers in ocular and systemic disease: potential use for predictive, preventive and personalised medicine. EPMA J. 7, 15 (2016).
  6. Rentka, A., et al. Membrane array and multiplex bead analysis of tear cytokines in systemic sclerosis. Immunol Res. 64 (2), 619-626 (2016).
  7. Zhou, L., Beuerman, R. W. Tear analysis in ocular surface diseases. Prog Retin Eye Res. 31 (6), 527-550 (2012).
  8. Jackson, D. C., et al. Tear Interferon-Gamma as a Biomarker for Evaporative Dry Eye Disease. Invest Ophthalmol Vis Sci. 57 (11), 4824-4830 (2016).
  9. Agrawal, R., et al. A distinct cytokines profile in tear film of dry eye disease (DED) patients with HIV infection. Cytokine. 88, 77-84 (2016).
  10. Uchio, E., Ono, S. Y., Ikezawa, Z., Ohno, S. Tear levels of interferon-gamma, interleukin (IL) -2, IL-4 and IL-5 in patients with vernal keratoconjunctivitis, atopic keratoconjunctivitis and allergic conjunctivitis. Clin Exp Allergy. 30 (1), 103-109 (2000).
  11. Leonardi, A., Curnow, S. J., Zhan, H., Calder, V. L. Multiple cytokines in human tear specimens in seasonal and chronic allergic eye disease and in conjunctival fibroblast cultures. Clin Exp Allergy. 36 (6), 777-784 (2006).
  12. Enríquez-de-Salamanca, A., Calonge, M. Cytokines and chemokines in immune-based ocular surface inflammation. Expert Rev Clin Immunol. 4 (4), 457-467 (2008).
  13. Carreño, E., et al. Cytokine and chemokine tear levels in patients with uveitis. Acta Ophthalmol. , (2016).
  14. Bjerrum, K. B., Prause, J. U. Collection and concentration of tear proteins studied by SDS gel electrophoresis. Presentation of a new method with special reference to dry eye patients. Graefes Arch Clin Exp Ophthalmol. 232 (7), 402-405 (1994).
  15. Saijyothi, A. V., et al. Two dimensional electrophoretic analysis of human tears: collection method in dry eye syndrome. Electrophoresis. 31 (20), 3420-3427 (2010).
  16. Thakur, A., Willcox, M. D. Cytokine and lipid inflammatory mediator profile of human tears during contact lens associated inflammatory diseases. Exp Eye Res. 67 (1), 9-19 (1998).
  17. Wei, Y., Gadaria-Rathod, N., Epstein, S., Asbell, P. Tear cytokine profile as a noninvasive biomarker of inflammation for ocular surface diseases: standard operating procedures. Invest Ophthalmol Vis Sci. 54 (13), 8327-8336 (2013).
  18. Topcu-Yilmaz, P., et al. Determination of tear and serum inflammatory cytokines in patients with rosacea using multiplex bead technology. Ocul Immunol Inflamm. 21 (5), 351-359 (2013).
  19. Hagan, S., Tomlinson, A. Tear fluid biomarker profiling: a review of multiplex bead analysis. Ocul Surf. 11 (4), 219-235 (2013).
  20. Choi, R., et al. Serum inflammatory profiles in pulmonary tuberculosis and their association with treatment response. J Proteomics. 149, 23-30 (2016).
  21. Kang, J. H., Vanderstichele, H., Trojanowski, J. Q., Shaw, L. M. Simultaneous analysis of cerebrospinal fluid biomarkers using microsphere-based xMAP multiplex technology for early detection of Alzheimer’s disease. Methods. 56 (4), 484-493 (2012).
  22. Staples, E., Ingram, R. J., Atherton, J. C., Robinson, K. Optimising the quantification of cytokines present at low concentrations in small human mucosal tissue samples using Luminex assays. J Immunol Methods. 394 (1-2), 1-9 (2013).
  23. Inic-Kanada, A., et al. Comparison of ophthalmic sponges and extraction buffers for quantifying cytokine profiles in tears using Luminex technology. Mol Vis. 18, 2717-2725 (2012).
  24. Moncunill, G., Aponte, J. J., Nhabomba, A. J., Dobaño, C. Performance of multiplex commercial kits to quantify cytokine and chemokine responses in culture supernatants from Plasmodium falciparum stimulations. PLoS One. 8 (1), e52587 (2013).
  25. Loo, B. M., Marniemi, J., Jula, A. Evaluation of multiplex immunoassays, used for determination of adiponectin, resistin, leptin, and ghrelin from human blood samples, in comparison to ELISA assays. Scand J Clin Lab Invest. 71 (3), 221-226 (2011).
  26. Dupont, N. C., Wang, K., Wadhwa, P. D., Culhane, J. F., Nelson, E. L. Validation and comparison of luminex multiplex cytokine analysis kits with ELISA: determinations of a panel of nine cytokines in clinical sample culture supernatants. J Reprod Immunol. 66 (2), 175-191 (2005).
  27. Pickering, J. W., Martins, T. B., Schroder, M. C., Hill, H. R. Comparison of a multiplex flow cytometric assay with enzyme-linked immunosorbent assay for auantitation of antibodies to tetanus, diphtheria, and Haemophilus influenzae Type b. Clin Diagn Lab Immunol. 9 (4), 872-876 (2002).
  28. Biagini, R. E., Sammons, D. L., Smith, J. P., MacKenzie, B. A., Striley, C. A., et al. Comparison of a multiplexed fluorescent covalent microsphere immunoassay and an enzyme-linked immunosorbent assay for measurement of human immunoglobulin G antibodies to anthrax toxins. Clin Diagn Lab Immunol. 11 (1), 50-55 (2004).
  29. Wang, L. S., Leung, Y. Y., Chang, S. K., Leight, S., Knapik-Czajka, M., et al. Comparison of xMAP and ELISA assays for detecting cerebrospinal fluid biomarkers of Alzheimer’s disease. J Alzheimers Dis. 31 (2), 439-445 (2012).
  30. Kalsow, C. M., Reindel, W. T., Merchea, M. M., Bateman, K. M., Barr, J. T. Tear cytokine response to multipurpose solutions for contact lenses. Clin Ophthalmol. 7, 1291-1302 (2013).
  31. . The definition and classification of dry eye disease: report of the Definition and Classification Subcommittee of the International Dry Eye WorkShop (2007). The ocular surface. 5 (2), 75-92 (2007).
  32. Stenger, S., Röllinghoff, M. Role of cytokines in the innate immune response to intracellular pathogens. Ann Rheum Dis. 60, (2001).
  33. Li, S., et al. Antibody protein array analysis of the tear film cytokines. Optom Vis Sci. 85 (8), 653-660 (2008).
  34. Tighe, O., Negm, I., Todd, L., Fairclough, Utility, reliability and reproducibility of immunoassay multiplex kits. Methods. 61 (1), 23-29 (2013).
  35. Dionne, K., Redfern, R. L., Nichols, J. J., Nichols, K. K. Analysis of tear inflammatory mediators: A comparison between the microarray and Luminex methods. Mol Vis. 22, 177-188 (2016).
  36. Sitaramamma, T., Shivaji, S., Rao, G. N. HPLC analysis of closed, open, and reflex eye tear proteins. Indian J Ophthalmol. 46 (4), 239-245 (1998).
  37. Saijyothi, A. V., et al. Two dimensional electrophoretic analysis of human tears: collection method in dry eye syndrome. Electrophoresis. 31 (20), 3420-3427 (2010).
  38. VanDerMeid, K. R., Su, S. P., Krenzer, K. L., Ward, K. W., Zhang, J. Z. A method to extract cytokines and matrix metalloproteinases from Schirmer strips and analyze using Luminex. Mol Vis. 17, 1056-1063 (2011).
  39. Khalifian, S., Raimondi, G., Brandacher, G. The use of luminex assays to measure cytokines. J Invest Dermatol. 135 (4), e31 (2015).
  40. Richens, J. L., Urbanowicz, R. A., Metcalf, R., Corne, J., O’Shea, P., Fairclough, L. Quantitative validation and comparison of multiplex cytokine kits. J Biomol Screen. 15 (5), 562-568 (2010).
  41. Berthoud, T. K., et al. Comparison of commercial kits to measure cytokine responses to Plasmodium falciparum by multiplex microsphere suspension array technology. Malar J. 10, 115 (2011).
  42. Boehm, N., Riechardt, A. I., Wiegand, M., Pfeiffer, N., Grus, F. H. Proinflammatory cytokine profiling of tears from dry eye patients by means of antibody microarrays. Invest Ophthalmol Vis Sci. 52 (10), 7725-7730 (2011).
  43. Sack, R., Conradi, L., Beaton, A., Sathe, S., McNamara, N., Leonardi, A. Antibody array characterization of inflammatory mediators in allergic and normal tears in the open and closed eye environments. Exp Eye Res. 85 (4), 528-538 (2007).

Tags

Tear Cytokine ProfileBead-based Multiplex AssaySchirmer StripOphthalmologyCytokinesOcular DiseasesAnalytesTear SampleAssay BufferCentrifugationCytokine ProfilingMultiplex AssayCytokine StandardsAssay WorksheetMagnetic Plate Washer

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Cite This Article
Balne, P. K., AU, V. B., Tong, L., Ghosh, A., Agrawal, M., Connolly, J., Agrawal, R. Bead Based Multiplex Assay for Analysis of Tear Cytokine Profiles. J. Vis. Exp. (128), e55993, doi:10.3791/55993 (2017).
Download Citation
Reprints and Permissions

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image