Fatia Patch Clamp técnica para análise de plasticidade induzida pela aprendizagem

Como descrevemos recentemente7, formação de haste do rotor (figura 1A) induzido mudanças dinâmicas na plasticidade intrínseca dos neurônios M1 camada II/III piramidais. Medir a latência até os ratos caem da haste rotativa permite estimar o desempenho de aprendizagem hábil do rato. Latência mais indica melhor desempenho motor. No dia 1 do treinamento, os ratos melhoraram seu desempenho de haste do rotor até o julgamento terminou. No dia 2, os ratos alcançado níveis quase assintótica na sessão em média escores (figura 1B). Comparado com a latência no primeiro julgamento, a análise post-hoc mostrou melhorias significativas no julgamento final sobre os dias de treinamento (Figura 1). A figura 4A mostra um exemplo de análise de corrente-grampo, no qual as propriedades neuronais alterada após a aprendizagem da habilidade motora. Injeções de pA 400 e 500 correntes pA eram necessários para induzir os potenciais de ação no grupo destreinado e nos ratos treinados dia-1, respectivamente. Em contraste, a injeção de apenas um pA 150 atual foi suficiente para provocar potenciais de ação nos ratos treinados 2 dias. A relação entre a intensidade de corrente e o número de potenciais de ação é mostrada na Figura 4B. Tão pouco quanto 50 AP atual foi suficiente para provocar picos em ratos treinados 2 dias; em contraste, 1 dia ratos treinados responderam com menos potenciais de ação que ratos destreinados para 350 pA e correntes mais elevadas. Além disso, a Figura 4 mostra que ratos treinados 1 dia mostraram baixa descansando potenciais, maior spike limiar e afterhyperpolarization mais profundo, Considerando que ratos treinados 2 dias mostraram maior potencial de repouso (Figura 4) e (de resistência de membrana A Figura 4). Como descrevemos anteriormente11, treinamento de IA (Figura 1) induzido pós-sináptica plasticidade em sinapses excitatórias e inibitórias dos neurônios hippocampal CA1. Ao medir a latência em caixa de luz, nós poderia estimar o desempenho de aprendizagem contextual do rato. Figura 1E mostra os resultados da tarefa IA. Após o choque elétrico emparelhado, os ratos aprendem a evitar o lado escuro da caixa e ficar no lado iluminado, que geralmente não prefeririam. A tendência de evitar o lado negro, portanto, indica a aquisição de memórias contextuais. A Figura 5 mostra um exemplo de análise de tensão-braçadeira em miniatura que correntes pós-sinápticas foram drasticamente alteradas após a aprendizagem contextual. Para investigar a plasticidade induzida pela aprendizagem, espontâneo mediada por Leandro mEPSCs e GABAA-mediadas mIPSCs sequencialmente foram gravadas na presença de 0,5 tetrodotoxina µM (Figura 5A e B). Como mostrado em parcelas bidimensionais (Figura 5), cada neurônio CA1 tinha diferentes amplitudes de média para mEPSCs e mIPSCs. Embora as amplitudes foram baixas e mostraram uma gama estreita distribuição em destreinados, pareado, e ratos de passo a passo, eram diversas em ratos treinados IA (tabela 5). ANOVA seguido de análise post-hoc mostrou um aumento significativo da médios amplitudes de mEPSC e mIPSC em ratos treinados IA (Figura 5E), sugerindo a plasticidade pós-sináptica induzida em aprendizagem nos neurônios CA1. Além disso, cada neurônio CA1 exibiu diferentes frequências de mEPSC e mIPSC (Figura 5). Embora as frequências foram baixas e mostraram uma gama estreita distribuição em destreinados, pareado, e ratos de passo a passo, eram diversas em ratos treinados IA (quadro 6). ANOVA seguido de análise post-hoc mostrou um aumento significativo nas frequências dos eventos mEPSC e mIPSC em ratos treinados IA (Figura 5F). Há duas possíveis interpretações destes resultados. A primeira é que a aprendizagem contextual aumentou o número de sinapses funcionais dos neurônios. O outro é que a aprendizagem contextual aumentou a probabilidade de liberação pré-sináptica de glutamato e GABA. Para aprofundar a análise de plasticidade pré-sináptica, realizamos também emparelhado-pulso estímulos, como relatado anteriormente,10,11. Figura 1 : Aprendizagem desempenho após o treino. A: O desenho experimental mostra a formação de vara de rotor e fatias coronais do cérebro. B: A latência média cair do tambor de vara de rotor acelerada. C: A latência média de cair fora a haste sobre o primeiro e os ensaios finais na formação dias 1 e 27. P< 0,01 vs primeiro julgamento. D: esquema da evasão inibitório (IA) tarefa e coronal cérebro fatia. E: A latência média para entrar a caixa escura antes e depois IA formação11. P< 0,01 vs antes do treino de IA. Os números pelas seções coronais indicam a distância à frente o bregma em mm. O número de animais é mostrado na parte inferior das barras. Barras de erro indicam SEM. clique aqui para ver uma versão maior desta figura. Figura 2 : Fatia procedimentos. A: as fotografias mostram a preparação de fatias cerebral aguda. As ferramentas de dissecação foram refrigeradas no antes do gelo picado para usar. B: dissecção e remoção do cérebro. Observe que o ângulo de corte do lado posterior deve ser orientado em paralelo com a orientação dendrítica. C: cortar o cérebro em uma câmara de vibratome. O cérebro é banhado no buffer de dissecação e borbulhava continuamente com uma mistura de gás 5% CO295% O2 . D: uma câmara de interface é constituído por dois recipientes de comida de plástico e um tubo de silicone. A câmara foi preenchida com CSF artificial e borbulhava continuamente com a mistura de gases. E: fatias do cérebro foram colocadas no papel de filtro molhado na câmara.Barra = 5 mm. clique aqui para ver uma versão maior desta figura. Figura 3 : Procedimentos de braçadeira Patch. A: O sistema de remendo-braçadeira costumava gravar sinais elétricos de um neurônio. A localização do estímulo e gravação eletrodos nos neurônios camada II/III são mostradas no córtex motor de ratos. B: para analisar as sinapses Schaffer de um neurônio piramidal CA1, um estimulante eletrodo foi colocado no radiatum estrato. Para analisar as sinapses temporoammonic, um estimulante eletrodo foi colocado no moleculare estrato. Representante da Leandro evocado e NMDA mediada por receptores excitatórios pós-sinápticos correntes no mesmo neurônio CA1 são mostradas. C: uma fatia de âncora foi usada para estabilizar a fatia na câmara de gravação. D: um mapa de representação no córtex motor, com base em artigos publicados15,16,17. ML = mediana. E: Micrografias de IR-DIC de M1 neurônios II/III antes da camada (superior) e durante a gravação (inferior). Bar = 10 µm. F: mudanças em pipeta atual antes de toque (topo) e na ruptura de membrana (inferior). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura. Figura 4 : Resultados representativos de análise de corrente-braçadeira7 . A: traços representativos dos potenciais de ação registrada após indução com injeções de corrente. B: as relações entre a entrada atual média (pA) vs. saída do potencial de ação (número de picos) em fatias de cérebro do destreinado (barras abertas), 1-dia treinadas (barras cinza) e 2 dias ratos treinados (bares cheios). C: afterhyperpolarization dos neurônios camada II/III, limiar e potencial de repouso. D: resistência da membrana e resistência série dos neurônios. Usamos a 9-10 ratos em cada grupo. O número de células é mostrado dentro de cada barra. Barras de erro indicam a SEM. *P< 0.05, * *P< 0,01 vs destreinados. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura. Figura 5 : Resultados representativos do tensão-braçadeira análise11 .Traços representativos de miniatura excitatórios e inibitórios pós-sinápticos correntes (mEPSCs e mIPSCs) no destreinado (A) e evasão inibitório (IA)-treinados ratos (B). mEPSCs-60 mV e mIPSCs em 0 mV foram medidos sequencialmente no mesmo neurônio piramidal CA1 na presença de tetrodotoxina (0,5 µM). Barra vertical = 20 pA, barra horizontal = 200 mseg. C: bidimensional de parcelas a média mE (I) PSC amplitudes em destreinados, IA-treinado, não pareado e noções básicas ratos. D: parcelas bidimensionais de mim (I) PSC frequências em 4 grupos. Nota que cada neurônio CA1 exibiu diferentes falando de mim (I) frequências e amplitudes PSC. Treinamento de IA não só fortaleceu as amplitudes de média (E), mas também aumentou as frequências de mim (I) eventos PSC (F). Usamos 4-6 ratos em cada grupo. O número de células é mostrado na parte inferior das barras. Sinais de adição vermelhos (C, D) e bares com linhas verticais (E, F) indicam a média ± SEM. * *P< 0,01 vs destreinados ratos. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura. Buffer de dissecação (Total 1L) NaH2PO4 • 2 H2O 0,195 g 1,25 mmol/L KCl g 0,188 2,5 mmol/L CaCl2 0,074 g 0,5 mmol/L MgCl2 • 6 H2O 1,423 g 7.0 mmol/L Cloreto de colina g 12,579 90 mmol/L Ácido ascórbico g 2,340 11,6 mmol/L Ácido pirúvico 0,342 g 3.1 mmol/L NaHCO3 2,100 g 25 mmol/L Glicose 4,500 g 25 mmol/L Tabela 1: Uma receita para o buffer de dissecação CSF artificial (Total 1L) KCl g 0,186 2,5 mmol/L NaCl g 6,700 114,6 mmol/L NaH2PO4 •2H2, O 0,156 g 1 mmol/L Glicose 1,800 g 10 mmol/L NaHCO3 2,184 g 26 mmol/L 1M MgCl2 4 mL 4 mmol/L 1M CaCl2 4 mL 4 mmol/L Tabela 2: Uma receita para artificial de líquido cerebrospinal (CSF) Solução intracelular para braçadeira atual (Total 200 mL) KCl g 0,0746 5 mmol/L K-gluconato g 6,089 130 mmol/L HEPES 0,476 g 10 mmol/L EGTA g 0,0456 0,6 mmol/L 1M MgCl2 500 Μ l 2,5 mmol/L At2 ATP g 0,4408 4 mmol/L At3 GTP g 0,0418 0,4 mmol/L Fosfocreatina at g 0,510 10 mmol/L Tabela 3: Uma receita para uma solução intracelular para braçadeira atual para gravação Solução intracelular para braçadeira de tensão (Total 200 mL) CsMeSO3 5g.244 (5.814) * 115 mmol/L (127,5) * CsCl 0,672 g (0.252) * 20 mmol/L (7,5) * HEPES 0,476 g 10 mmol/L EGTA g 0,0456 0,6 mmol/L 1M MgCl2 500 Μ l 2,5 mmol/L At2 ATP g 0,4408 4 mmol/L At3 GTP g 0,0418 0,4 mmol/L Fosfocreatina at g 0,510 10 mmol/L * baixa concentração de Cl– para gravações em miniatura Tabela 4: Uma receita para uma solução intracelular para braçadeira de tensão para gravação Parâmetros sem treinamento IA treinado Não pareado Caminhe mEPSC amplitude Variação 5.8 32,1 4.7 5.9 Desvio-padrão 2.4 5.7 2.2 2.4 Coeficiente de variação 0.189 0.326 0,177 0,190 mIPSC amplitude Variação 17.1 56,7 31,8 20,7 Desvio-padrão 4.1 7.5 5.6 4.5 Coeficiente de variação 0.279 0,387 0,367 0.286 Tabela 5: A diversidade de miniatura excitatórios e inibitórios pós-sinápticos atual (mEPSC e mIPSC) amplitudes em evasão inibitório (IA)-treinados ratos Parâmetros sem treinamento IA treinado Não pareado Caminhe frequência mEPSC Variação 278 2195 188 195 Desvio-padrão 17 47 14 14 Coeficiente de variação 0.902 1.198 0.893 0.874 frequência mIPSC Variação 3282 27212 1385 5135 Desvio-padrão 57 165 37 72 Coeficiente de variação 1.195 1.006 0.955 0.836 Tabela 6: A diversidade de miniatura excitatórias e inibitórias pós-sinápticos atual (mEPSC e mIPSC) frequências em evasão inibitório (IA)-treinados ratos