تصحيح شريحة المشبك تقنية لتحليل اللدونة المستحثة بالتعلم
Summary
تقنية شريحة المشبك التصحيح طريقة فعالة لتحليل التغيرات المستحثة بالتعلم في الخصائص الجوهرية واللدونه من نهايات ضادات أو المثبطة.
Abstract
تقنية شريحة المشبك التصحيح أداة قوية للتحقيق اللدونة العصبية الناجمة عن التعلم في مناطق محددة من الدماغ. لتحليل التعلم موتور اللدونة المستحث، قمنا بتدريب الفئران استخدام مهمة رود دوار المعجل. الفئران أداء المهمة 10 مرات على فترات 30-s لأيام 1 أو 2. تم تحسين الأداء كثيرا في أيام التدريب مقارنة بالمحاكمة الأولى. ثم أعددنا شرائح الدماغ الحادة من القشرة الحركية الأولية (M1) في الفئران غير مدربين والمدربين. أظهر التحليل الحالي-المشبك التغيرات الدينامية في استراحة غشاء المحتملة، وعتبة سبايك، أفتيرهايبربولاريزيشن، ومقاومة الغشاء في طبقة الثاني/الثالث من الخلايا العصبية الهرمية. الحقن الحالية الناجمة عن العديد من المسامير أكثر في الفئران مدربين 2 يوم من الضوابط غير مدربين.
لتحليل التعلم حسب السياق اللدونة المستحث، وقمنا بتدريب الفئران باستخدام مهمة إبطال مثبطة (IA). بعد أن عانى من صدمة القدم في الجانب المظلم من مربع، تعلمت الفئران لتجنب ذلك، البقاء في الجانب المضاء. نحن على استعداد شرائح هيبوكامبال الحادة غير مدربين، تدريب IA، مزاوج، والفئران التي يمر عبرها. تحليل الجهد-المشبك استخدمت لتسجيل مصغرة عليه والمثبطة بوستسينابتيك التيارات (ميبسكس وميبسكس) من الخلايا العصبية CA1 نفس التسلسل. وجدنا مختلفة ستريك يعني ميبسك وميبسك في كل CA1 الخلايا العصبية، مما يوحي بأن كل الخلايا العصبية القوة بوستسينابتيك مختلفة في نهايات ضادات والمثبطة لها. وعلاوة على ذلك، بالمقارنة مع عناصر التحكم غير مدربين، IA-بتدريب الفئران قد ستريك ميبسك وميبسك أعلى، مع التنوع الواسع. واقترحت هذه النتائج أن التعلم السياقية يخلق التنوع بوستسينابتيك في نهايات كل ضادات والمثبطة في كل CA1 الخلايا العصبية.
مستقبلاتA امبا أو GABA التوسط التيارات بوستسينابتيك، منذ حمام العلاج مع كنقكس على ما يبدو، أو حظر بيكوكوليني أحداث ميبسك أو ميبسك، على التوالي. يمكن استخدام هذا الأسلوب لدراسة أنواع مختلفة من التعلم في مناطق أخرى، مثل القشرة الحسية واللوزة.
Introduction
وقد استخدمت تقنية المشبك التصحيح، التي وضعتها نيهر وزاكمان، على نطاق واسع للتجارب الكهربية1. يمكن أن تستخدم تقنية المشبك تصحيح كامل الخلية2 لتسجيل الحالية داخل الخلايا أو الجهد باستخدام ختم جيجاوهم لغشاء الخلية. تقنية المشبك الحالي يسمح لنا بتحليل الاختلافات في خصائص الغشاء مثل يستريح المحتملة والمقاومة والسعة3. تقنية الجهد-المشبك يسمح لنا بتحليل المستحثة بالتعلم اللدونة متشابك في نهايات ضادات والمثبطة على حد سواء.
القشرة الحركية الأولية (M1) هي منطقة مركزية أمر بالغ الأهمية لجعل الحركات الطوعية المهرة. وأظهرت دراسات الكهربية السابقة تنمية طويلة الأجل التقوية (الكمونية)-مثل اللدونة في طبقة سينابسيس الثاني/الثالث عليه بعد التدريب الحركي المهرة4. وعلاوة على ذلك، في فيفو التصوير دراسات أخرى أظهرت إعادة عرض العمود الفقري الجذعية M1 بعد مهمة التوصل إلى مهرة5،6. ومع ذلك، لم يتم إظهار اللدونة متشابك والجوهرية الناجمة عن التعلم في الخلايا العصبية M1.
نحن ذكرت مؤخرا أن مهمة رود دوار شجعت التغيرات الدينامية في جلوتاماتيرجيك وجابايرجيك سينابسيس وغيرت اللدونة المتأصلة في M1 طبقة الثاني/الثالث من الخلايا العصبية7. هنا استخدمنا تقنية المشبك التصحيح شريحة للتحقيق اللدونة المستحثة بالتعلم. يمكن أيضا استخدام هذه التقنية للتحقيق في أنواع أخرى من اللدونة تعتمد على التجربة في مناطق أخرى في الدماغ. على سبيل المثال، يمكن تعزيز مدخلات الحسية في قشرة البرميل امبا بوساطة مستقبلات مدخلاً عليه في طبقة الخلايا العصبية الثاني/الثالث8، ويعزز الخوف ملقن تكييف المدخلات ضادات على الخلايا العصبية اللوزة الأفقي، مما هو مطلوب ويخشى الذاكرة9. وعلاوة على ذلك، يقوم التعلم السياقية التنوع من حيث مدخلات متشابك ضادات والمثبطة للخلايا العصبية CA1 هيبوكامبال10،11.
Protocol
Representative Results
Discussion
القيد الرئيسي تقنية المشبك التصحيح شريحة هو التسجيل في إعداد شريحة، التي قد لا تعكس ما يحدث في الجسم الحي. على الرغم من أن التحليل الحالي-المشبك في فيفو أكثر موثوقية، فإنه يمثل تحديا تقنيا للحصول على بيانات كافية من الحيوانات واعية. وبكل العصبية الهرمية الخصائص الخلوية المختلفة، يلزم عدد كاف من الخلايا بشكل صحيح تحليل الاختلافات في الخلايا العصبية بعد التدريب. وعلاوة على ذلك، يتطلب تحليل الجهد-المشبك العلاج من تعاطي المخدرات مستمر مع كنقكس أو أبف أو بيكوكوليني لتحديد طبيعة الاستجابات بوستسينابتيك. لتحليل الردود مصغرة الناجم عن حويصلة واحدة غلوتامات أو GABA، مطلوب علاج متواصل مع تيدرودوتاكسين لعرقلة إمكانات العمل العفوي. على الرغم من أن تقنية التصوير المتعدد فوتون وضعت مؤخرا قوية لتحليل التغييرات الشكلية في نهايات ضادات19، مطلوب تقنية المشبك تصحيح مجتمعة لتحليل الدالة من نقاط الاشتباك العصبي في الجسم الحي. من الصعب جداً حاليا لتحليل التغييرات الشكلية في الاشتباكات العصبية المثبطة، منذ نهايات معظم المثبطة لا تشكل العمود الفقري. وفي هذا الوقت، سيكون المشبك التصحيح شريحة الأسلوب الأكثر ملاءمة لتحليل خصائص الخلية أو مهام نهايات ضادات/المثبطة في الحيوانات المدربة.
استخدام التحليل الحالي-المشبك (الشكل 4)، أبلغنا مؤخرا موتور اللدونة المتأصلة الناجمة عن التعلم في طبقة الثاني/الثالث من الخلايا العصبية. على وجه التحديد، 1 أيام المدربين الفئران أظهرت انخفاضا كبيرا في استراحة غشاء المحتملة وزيادة في عتبة سبايك. 2-يوم تدريب الفئران أظهرت زيادة كبيرة في استراحة غشاء المحتملة التي أدت إلى زيادة حدة. واقترحت هذه النتائج أن هناك كانت التغيرات الدينامية في اللدونة الجوهرية M1 طبقة الثاني/الثالث الخلايا العصبية في الفئران المدربة. وكشف تحليل المشبك الجهد الإضافي زيادة في نسبة النبض إقران في الفئران المدربة 1 يوم، مما يوحي بأنه كان هناك انخفاض عابر في احتمال الإفراج عن7غابا presynaptic. ولذلك فمن الممكن أن إزالة التثبيط من GABA في طبقة سينابسيس الثاني/الثالث قد تؤدي اللدونة المستحثة بالتعلم الناتجة في M1. ودعما لذلك، يتطلب إعداد شريحة M1 حمام العلاج مع حظر الإطارات مستقبلات GABAA لحمل LTP20.
تحليل إمكانيات بوستسينابتيك مصغرة وسيلة قوية لكشف اللدونة متشابك في IA-تدريب الحيوانات. متسلسلة من تسجيل ميبسكس وميبسكس في واحد CA1 الخلايا العصبية يسمح تحليل قوة ضادات/المثبطة متشابك لكل الخلايا العصبية الفردية. منذ واحد لي (ط) PSC استجابة يعزى إلى حويصلة واحدة غلوتامات أو غابا، زيادة لي (ط) PSC في السعة وتقترح تعزيز بوستسينابتيك. استخدام لي (ط) تحليل PSC، وجدنا الفروق الفردية في قوام ضادات/المثبطة مدخلات كل CA1 الخلايا العصبية (الشكل 5). تعزيز التدريب IA وضوح التنوع في قوة متشابك، ولكن هذا لم يلاحظ في المجموعات الأخرى (الجدول 5).
يمكن تحليل التنوع متشابك المستحثة بالتعلم رياضيا. بحساب احتمال ظهور كل نقطة، يمكن تحويل البيانات من كل الخلايا العصبية بالذات-الانتروبيا (بت) باستخدام معلومات نظرية كلود شانون هاء21. نقطة مع احتمال ظهور عالية (حول مستوى متوسط) يشير إلى المتمتعة بالحكم الذاتي-الانتروبيا منخفضة، بينما يشير إلى نقطة مع احتمال نادر جداً (نقطة انحرفت) المتمتعة بالحكم الذاتي-الانتروبيا عالية. بالمقارنة مع الفئران غير مدربين، المتمتعة بالحكم الذاتي-القصور حراري كل الخلايا العصبية زيادة وضوح في الفئران التي دربت IA لكن مزاوج ليس في أو يمر عبرها الفئران22. هذا التحليل يشير إلى أن هناك زيادة في المعلومات داخل CA1 بعد التعلم السياقية.
يمكن أيضا استخدام تقنية المشبك التصحيح شريحة ملقن خوفاً من تكييف الدراسات في اللوزة الجانبي9 والدراسات التجربة الحسية في قشرة البرميل8. وعلاوة على ذلك، يمكن استخدام هذه التقنية مع تقنيات أخرى مختلفة لإجراء مزيد من التحقيقات. على سبيل المثال، الفيروس بوساطة أخضر نيون البروتين (التجارة والنقل)-يمكن الجمع بين تقنية إيصال الجينات المعلمة مع تقنية المشبك التصحيح لتحليل وظيفة جزيئات محددة. وبالإضافة إلى ذلك، يمكن استخدام microinjection المحورية للراسم الوراء لتصور ذلك المشروع إلى منطقة معينة محددة من الخلايا العصبية. ثم، باستخدام تقنية المشبك الحالية، يمكن تحليل الخصائص الخاصة بالخلية في الخلايا العصبية تصور23. علاوة على ذلك، استخدمت الجمع بين اثنين-فوتون ليزر المسح المجهري مع الليزر اثنين-فوتون أونكاجينج الغلوتامات لإظهار النمو الخاصة بالعمود الفقري ورد ابسك في الماوس القشرية طبقة الخلايا العصبية الهرمية الثاني/الثالث19. وهكذا، يجري تحسين تقنية المشبك التصحيح شريحة بالجمع بينها وبين رواية من المواد الكيميائية وإيصال الجينات وتقنيات معالجة الصور.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
ونود أن نشكر الدكتور مخلب-دقيقة-ثين-سين سين، والدكتور هان-عبووودي الشفر-زين، والسيدة تسوروتاني H. للمساعدة التقنية. هذا المشروع كان يدعمها الإقراض للعلماء الشباب (الكوري و Y.S.)، وب البحوث العلمية (مارك)، ج البحوث العلمية (مارك)، والبحث العلمي في مبتكرة مجالات (مارك)، من وزارة التربية والتعليم، والثقافة، والرياضة، العلوم، و التكنولوجيا في اليابان.
Materials
| Rota-Rod Treadmills | Med Associates Inc. | ENV577 | |
| inhibitory avoidance box | Shinano Seisakusho | ||
| Pentobarbital | Kyoritsu Seiyaku | ||
| Blade | Nisshin EM Co., Ltd | LC05Z | |
| Cardiac perfusion syringe | JMS Co., Ltd | JS-S00S | |
| Vibratome | Leica Microsystems | VT-1200 | |
| Horizontal puller | Sutter Instrument | Model P97 | |
| Microfilm 34 gauge | World Precision Instruments, Inc | MF34G-5 | |
| 0.22 µm filter | Millipore | SLGVR04NL | |
| Axopatch–1D amplifier | Axon Instruments | ||
| Digidata 1440 AD board | Axon Instruments | ||
| pCLAMP 10 software | Axon Instruments | ||
| Upright Microscope | Olympus | BX51WI | |
| CCD camera | Olympus | U-CMAD3 | |
| Camera controller | Hamamatsu Photonics K.K. | C2741 | |
| Stimulator | Nihon Kohden | SEN-3301 | |
| Isolator | Nihon Kohden | SS-104J | |
| Motorized manipulator | Sutter Instrument | MP-285 | |
| Micromanipulator | Narishige | NMN-21 | |
| Peristaltic Pump | Gilson, Inc | MINIPULS® 3 | |
| Glass capillary | Narishige | GD-1.5 | |
| Ag/AgCl electrode | World Precision Instruments, Inc | EP4 | |
| Slice Anchor | Warner instruments | 64-0252 | |
| Stimulus electrode | Unique Medical Co., Ltd | KU201-025B | |
| Materials | Company | Catalog Number | Comments |
| Dissection buffer/ artificial CSF |
|||
| NaH2PO4 • 2H2O | Sigma-Aldrich Co. | C1426 | |
| KCl | Wako Pure Chemical Industries | 163-03545 | |
| CaCl2 | Wako Pure Chemical Industries | 039-00475 | |
| MgCl2 • 6H2O | Wako Pure Chemical Industries | 135-00165 | |
| Choline chloride | Sigma-Aldrich Co. | C7527 | |
| Ascorbic acid | Wako Pure Chemical Industries | 190-01255 | |
| Pyruvic acid Na | Wako Pure Chemical Industries | 199-03062 | |
| NaHCO3 | Sigma-Aldrich Co. | 28-1850-5 | |
| Glucose | Sigma-Aldrich Co. | 07-0680-5 | |
| Materials | Company | Catalog Number | Comments |
| Intracellular solution | |||
| K-Gluconate | Sigma-Aldrich Co. | G4500 | |
| HEPES | Wako Pure Chemical Industries | 346-01373 | |
| EGTA | Wako Pure Chemical Industries | 348-01311 | |
| Na2 ATP | Nacalai Tesque | 01072-24 | |
| Na3 GTP | Sigma-Aldrich Co. | G-8877 | |
| Na phosphocreatine | Sigma-Aldrich Co. | P-7936 | |
| CsMeSO3 | Sigma-Aldrich Co. | C1426 | |
| CsCl | Wako Pure Chemical Industries | 033-01953 | |
| Materials | Company | Catalog Number | Comments |
| Drugs in aCSF | |||
| 2-Chloroadenosine | Sigma-Aldrich Co. | C5134 | |
| Picrotoxin | Sigma-Aldrich Co. | P-1675 | |
| Tetrodotoxin | Wako Pure Chemical Industries | 207-15901 | |
| CNQX | Sigma-Aldrich Co. | C239 | |
| APV | Sigma-Aldrich Co. | A5282 |
References
- Neher, E., Sakmann, B. Single-channel currents recorded from membrane of denervated frog muscle fibres. Nature. 260 (5554), 799-802 (1976).
- Hamill, O. P., Marty, A., Neher, E., Sakmann, B., Sigworth, F. J. Improved patch-clamp techniques for high-resolution current recording from cells and cell-free membrane patches. Pflugers Arch. 391 (2), 85-100 (1981).
- Edwards, F. A., Konnerth, A., Sakmann, B., Takahashi, T. A thin slice preparation for patch clamp recordings from neurones of the mammalian central nervous system. Pflugers Arch. 414 (5), 600-612 (1989).
- Rioult-Pedotti, M. S., Friedman, D., Donoghue, J. P. . Learning-induced LTP in neocortex. Science. 290 (5491), 533-536 (2000).
- Yang, G., Pan, F., Gan, W. B. Stably maintained dendritic spines are associated with lifelong memories. Nature. 462 (7275), 920-924 (2009).
- Xu, T., et al. Rapid formation and selective stabilization of synapses for enduring motor memories. Nature. 462 (7275), 915-919 (2009).
- Kida, H., et al. Motor Training Promotes Both Synaptic and Intrinsic Plasticity of Layer II/III. Pyramidal Neurons in the Primary Motor Cortex. Cereb Cortex. 26 (8), 3494-3507 (2016).
- Takahashi, T., Svoboda, K., Malinow, R. Experience strengthening transmission by driving AMPA receptors into synapses. Science. 299 (5612), 1585-1588 (2003).
- Rumpel, S., LeDoux, J., Zador, A., Malinow, R. Postsynaptic receptor trafficking underlying a form of associative learning. Science. 308 (5718), 83-88 (2005).
- Mitsushima, D., Ishihara, K., Sano, A., Kessels, H. W., Takahashi, T. Contextual learning requires synaptic AMPA receptor delivery in the hippocampus. Proc Natl Acad Sci U S A. 108 (30), 12503-12508 (2011).
- Mitsushima, D., Sano, A., Takahashi, T. A cholinergic trigger drives learning-induced plasticity at hippocampal synapses. Nat Commun. 4, 2760 (2013).
- Kida, H., Mitsushima, D. Patch Clamp Technique in Brain Slices: Recording of Neuronal Activity in the Rat Primary Motor Cortex. Yamaguchi Medical Journal. 63, (2014).
- Watt, A. J., van Rossum, M. C., MacLeod, K. M., Nelson, S. B., Turrigiano, G. G. Activity coregulates quantal AMPA and NMDA currents at neocortical synapses. Neuron. 26 (3), 659-670 (2000).
- Baidan, L. V., Zholos, A. V., Wood, J. D. Modulation of calcium currents by G-proteins and adenosine receptors in myenteric neurones cultured from adult guinea-pig small intestine. Br J Pharmacol. 116 (2), 1882-1886 (1995).
- Tandon, S., Kambi, N., Jain, N. Overlapping representations of the neck and whiskers in the rat motor cortex revealed by mapping at different anaesthetic depths. Eur J Neurosci. 27 (1), 228-237 (2008).
- Adachi, K., Murray, G. M., Lee, J. C., Sessle, B. J. Noxious lingual stimulation influences the excitability of the face primary motor cerebral cortex (face MI) in the rat. J Neurophysiol. 100 (3), 1234-1244 (2008).
- Tennant, K. A., et al. The organization of the forelimb representation of the C57BL/6 mouse motor cortex as defined by intracortical microstimulation and cytoarchitecture. Cereb Cortex. 21 (4), 865-876 (2011).
- Pinheiro, P. S., Mulle, C. Presynaptic glutamate receptors: physiological functions and mechanisms of action. Nat Rev Neurosci. 9 (6), 423-436 (2008).
- Kwon, H. B., Sabatini, B. L. Glutamate induces de novo growth of functional spines in developing cortex. Nature. 474 (7349), 100-104 (2011).
- Hess, G., Donoghue, J. P. Long-term potentiation of horizontal connections provides a mechanism to reorganize cortical motor maps. J Neurophysiol. 71 (6), 2543-2547 (1994).
- Shannon, C. E. A mathematical theory of communication. Bell Sys Tech J. 27, (1948).
- Ono, K. M., D, Learning creates diversity of excitatory and inhibitory synapses in the hippocampal CA1: a possible amount of information at a single synapse. J Physiol Sci. 67, (2017).
- Wang, L., Conner, J. M., Rickert, J., Tuszynski, M. H. Structural plasticity within highly specific neuronal populations identifies a unique parcellation of motor learning in the adult brain. Proc Natl Acad Sci U S A. 108 (6), 2545-2550 (2011).
