Slice-Patch-Clamp-Technik für die Analyse von Learning-induzierte Plastizität

Wie wir vor kurzem7beschrieben, induziert Rotor Stab Ausbildung (Abbildung 1A) dynamische Veränderungen in der intrinsischen Plastizität der M1 Layer II/III pyramidalen Neuronen. Die Latenz zu messen, bis die Ratten aus den rotierenden Stab fallen ermöglicht es uns, die qualifizierte Lernleistung der Ratte zu schätzen. Längere Wartezeit bedeutet bessere Motorleistung. Am Tag 1 Training verbessert die Ratten Rotor Stab bis der Prozess beendet. Am 2. Tag, die Ratten erreicht fast asymptotische Ebenen in der gemittelten Sitzung punktet (Abbildung 1 b). Im Vergleich mit der Wartezeit bei der ersten Verhandlung, Post-hoc- Analyse zeigten signifikante Verbesserungen bei den abschließenden Prüfungen an den Trainingstagen (Abbildung 1). Abbildung 4A zeigt ein Beispiel für Strom-Clamp-Analyse in der neuronalen Eigenschaften nach dem motorischen lernen geändert. Injektionen von 400 pA und 500 pA Strömungen waren nötig, um Aktionspotentiale in der ungeübte Gruppe und bei den 1-Tages ausgebildete Ratten, bzw. zu induzieren. Im Gegensatz dazu genügte Injektion nur eines 150 Pa aktuellen Aktionspotentiale in der 2-Tages ausgebildete Ratten zu entlocken. Abbildung 4 bzeigt die Beziehung zwischen der Stromstärke und der Anzahl der Aktionspotentiale. So wenig wie 50 pA aktuellen genügte, um Spitzen in der 2-Tages ausgebildete Ratten zu entlocken; im Gegensatz dazu reagiert 1 Tag ausgebildete Ratten mit weniger Aktionspotentiale als untrainierte Ratten auf 350 pA und höhere Ströme. Darüber hinaus Abbildung 4 zeigt, dass 1 Tag ausgebildete Ratten zeigten geringere ruht potential, höher spike Schwelle und tieferen Afterhyperpolarization, während 2-tägigen ausgebildete Ratten zeigte höhere Ruhepotential (Abbildung 4) und Widerstand () Membran Abbildung 4). Wie wir bereits11beschrieben, induzierte IA Training (Abbildung 1) postsynaptischen Plastizität an erregenden und hemmenden Synapsen der hippocampalen CA1 Neuronen. Durch die Messung der Latenz im Lichtkasten, könnten wir die kontextbezogene Lernleistung der Ratte schätzen. Abbildung 1E zeigt die Ergebnisse der Aufgabe IA. Nach den gekoppelten elektrischen Schlag lernen die Ratten zu vermeiden die dunkle Seite des Kastens und bleiben in der beleuchteten Seite, die in der Regel nicht vorziehen würden. Die Tendenz, die dunkle Seite zu vermeiden zeigt daher die Übernahme von kontextuellen Erinnerungen. Abbildung 5 zeigt ein Beispiel für Voltage-Clamp-Analyse in der Miniatur postsynaptischen Ströme nach kontextuellen Lernens drastisch geändert wurden. Zu untersuchen, lernen-induzierte Plastizität, spontane AMPA-vermittelten mEPSCs und GABA-A-vermittelten mIPSCs wurden nacheinander in Gegenwart von 0,5 µM Tetrodotoxin (Abb. 5A und B) aufgenommen. Wie gezeigt auf zweidimensionalen Flächen (Abbildung 5), hatte jedes Neuron CA1 unterschiedliche mittleren Amplituden für mEPSCs und mIPSCs. Obwohl die Amplituden niedrig waren und einen schmalen Verbreitungsgebiet in zeigte ungeübt, ungepaarten, und begehbare Ratten waren vielfältig in IA ausgebildete Ratten (Tabelle 5). ANOVA, gefolgt von Post-hoc- Analyse zeigte eine signifikante Zunahme der mittleren Amplituden der mEPSC und mIPSC in IA ausgebildete Ratten (Abb. 5E), was lernen-induzierte postsynaptischen Plastizität in den CA1-Neuronen. Darüber hinaus stellte jedes Neuron CA1 verschiedene Frequenzen von mEPSC und mIPSC (Abbildung 5). Obwohl die Frequenzen niedrig waren und einen schmalen Verbreitungsgebiet in zeigte ungeübt, ungepaarten, und begehbare Ratten waren vielfältig in IA ausgebildete Ratten (Tabelle 6). ANOVA, gefolgt von Post-hoc- Analyse zeigte einen signifikanten Anstieg in den Frequenzen der mEPSC und mIPSC Ereignisse in IA ausgebildete Ratten (Abbildung 5F). Es gibt zwei mögliche Interpretationen dieser Ergebnisse. Die erste ist, dass kontextuellen Lernens die Anzahl der funktionellen Synapsen der Nervenzellen erhöht. Die andere ist, dass kontextuellen Lernens die Wahrscheinlichkeit der präsynaptischen Freisetzung von Glutamat und GABA erhöht. Um präsynaptischen Plastizität weiter zu untersuchen, führten wir auch gepaart-Puls Stimulationen, wie bereits berichtet,10,11. Abbildung 1 : Lernleistung nach dem Training. A: das experimentelle Design zeigt den Rotor Stab Ausbildung und koronalen Gehirn-Scheibe. B: die mittlere Latenz von der Beschleunigung Rotor Stab Lauf fallen. C: die mittlere Wartezeit aus dem Stab auf den ersten und den letzten Studien zur Ausbildung Tage 1 und 27fallen. P< 0,01 vs. erster Versuch. D: Schema der hemmenden Vermeidung (IA) Aufgabe und koronalen Gehirn Scheibe. E: die mittlere Wartezeit der dunklen Kasten vor und nach IA Training11eingeben. P< 0,01 vs. vor IA Training. Die Zahlen von der koronalen Abschnitte zeigen den Abstand anterior Bregma in mm. Die Anzahl der Tiere ist an der Unterseite der Balken angezeigt. Fehlerbalken zeigen SEM Klicken Sie bitte hier, um eine größere Version dieser Figur. Abbildung 2 : Slice Verfahren. A: Fotografien zeigen die Vorbereitung der akuten Hirnschnitten. Die Dissektion Werkzeuge wurden in zerstoßenem Eis vor dem Gebrauch gekühlt. B: Gehirn-Dissektion und trimmen. Beachten Sie, dass der Winkel des Ausschnitts auf der hinteren Seite parallel mit der dendritischen Orientierung ausgerichtet werden muss. C: das Gehirn in einer Vibratome Kammer schneiden. Das Gehirn ist in Dissektion Puffer gebadet und sprudelte kontinuierlich mit einem 5 % CO295 % O2 Gasgemisch. D: eine Schnittstelle Kammer machte zwei Kunststoff Essen-Container und ein Silikonschlauch. Die Kammer war gefüllt mit künstlichen CSF und blubberte kontinuierlich mit dem Gasgemisch. E: Gehirnscheiben wurden auf nassen Filterpapier in die Kammer gelegt.Bar = 5 mm. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur. Abbildung 3 : Patch-Clamp-Verfahren. A: der Patch-Clamp-System verwendet, um elektrische Signale von einer Nervenzelle zu erfassen. Die Lage der die anregende und Aufnahme von Elektroden in den Layer II/III-Neuronen sind im motorischen Kortex Ratte gezeigt. B: um die Schaffer Synapsen eines CA1 pyramidenförmigen Neurons zu analysieren, wurde eine anregende Elektrode an das Stratum Radiatum platziert. Um Temporoammonic Synapsen zu analysieren, wurde eine anregende Elektrode an das Stratum Moleculare gelegt. Vertreter der evozierten AMPA Spuren und NMDA-Rezeptor-vermittelten exzitatorischen postsynaptischen Ströme in der gleichen CA1 Nervenzelle dargestellt. C: ein Stück Anker wurde verwendet, um die Scheibe in der Aufnahme-Kammer zu stabilisieren. D: eine Darstellung Karte im motorischen Kortex, basierend auf den veröffentlichten Papiere15,16,17. ML = Mittellinie. E: IR-DIC Mikrographen M1 Schicht II/III-Neuronen vor (obere) und während der Aufnahme (niedriger). Bar = 10 µm. F: Änderungen in der Pipette aktuelle vor Touch (oben) und beim Membran Bruch (unten). Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur. Abbildung 4 : Repräsentative Ergebnisse von Strom-Clamp Analyse7 . A: repräsentative Spuren von Aktionspotentialen aufgezeichnet nach Induktion mit aktuellen Injektionen. B: Beziehungen zwischen der mittlere Stromeingang (pA) vs. Aktionspotential Ausgabe (Anzahl der Spikes) in Hirnschnitten von ungeschulten (offene Balken), 1-Tages ausgebildete (graue Balken) und 2-Tages ausgebildete Ratten (gefüllte Balken). C: Resting Potential, Schwelle und Afterhyperpolarization der Schicht II/III-Neuronen. D: Membran und Serie Beständigkeit der Neuronen. Wir haben 9-10 Ratten in jeder Gruppe. Die Anzahl der Zellen wird innerhalb jeder Balken angezeigt. Fehlerbalken zeigen SEM *P< 0,05, **P< 0,01 vs. ungeschult. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur. Abbildung 5 : Repräsentative Ergebnisse der Spannung-Clamp Analyse11 .Repräsentative Spuren der Miniatur exzitatorischen und inhibitorischen postsynaptischen Ströme (mEPSCs und mIPSCs) in ungeschulten (A) und hemmenden Vermeidung (IA)-Ratten (B) ausgebildet. mEPSCs bei-60 mV und mIPSCs bei 0 mV wurden nacheinander in der gleichen CA1 pyramidale Nervenzelle im Beisein von Tetrodotoxin (0,5 µM) gemessen. Vertikaler Balken = 20 pA, Reck = 200 msec. C: zweidimensionale Grundstücke des Mittelwerts mir (I) PSC Amplituden in ungeübt, IA ausgebildet, ungepaarten, und begehbare Ratten. D: zweidimensionale Darstellungen von mir (I) PSC Frequenzen in 4 Gruppen. Beachten Sie, dass jedes Neuron CA1 verschiedene ausgestellt bedeuten mir (I) PSC Amplituden und Frequenzen. IA Training verstärkt nicht nur die mittleren Amplituden (E), sondern auch die Frequenzen von mir (I) PSC Veranstaltungen (F). Wir haben 4-6 Ratten in jeder Gruppe. Die Anzahl der Zellen ist an der Unterseite der Balken angezeigt. Roten Pluszeichen (C, D) und Bars mit vertikalen Linien (E, F) zeigen den Mittelwert ± SEM. **P< 0,01 vs. ungeschult Ratten. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur. Dissektion Puffer (insgesamt 1L) NaH2PO4 • 2 H2O 0,195 g 1,25 Mmol/L KCl 0,188 g 2,5 Mmol/L CaCl2 0,074 g 0,5 Mmol/L MgCl2 • 6 H2O 1,423 g 7.0 Mmol/L Cholinchlorid 12,579 g 90 Mmol/L Ascorbinsäure 2,340 g 11.6 Mmol/L Brenztraubensäure Säure 0,342 g 3.1 Mmol/L Nahco33 2,100 g 25 Mmol/L Glukose 4,500 g 25 Mmol/L Tabelle 1: Ein Rezept für eine Dissektion Puffer Künstliche CSF (insgesamt 1L) KCl 0,186 g 2,5 Mmol/L NaCl 6,700 g 114.6 Mmol/L NaH2PO4 •2H2O 0,156 g 1 Mmol/L Glukose 1,800 g 10 Mmol/L Nahco33 2,184 g 26 Mmol/L 1M MgCl2 4 mL 4 Mmol/L 1M CaCl2 4 mL 4 Mmol/L Tabelle 2: Ein Rezept für künstliche Liquor cerebrospinalis (CSF) Intrazelluläre Lösung für Stromzange (insgesamt 200 mL) KCl 0,0746 g 5 Mmol/L K-Gluconat 6,089 g 130 Mmol/L HEPES 0,476 g 10 Mmol/L EGTA 0,0456 g 0,6 Mmol/L 1M MgCl2 500 ΜL 2,5 Mmol/L Na2 ATP 0,4408 g 4 Mmol/L Na3 GTP 0,0418 g 0,4 Mmol/L Na Phosphokreatin 0,510 g 10 Mmol/L Tabelle 3: Eine Rezept für eine intrazelluläre Lösung für Stromzange Aufnahme Intrazelluläre Lösung für Spannung Klemme (insgesamt 200 mL) CsMeSO3 5.244 g (5.814) * 115 Mmol/L (127,5) * CsCl 0,672 g (0.252) * 20 Mmol/L (7,5) * HEPES 0,476 g 10 Mmol/L EGTA 0,0456 g 0,6 Mmol/L 1M MgCl2 500 ΜL 2,5 Mmol/L Na2 ATP 0,4408 g 4 Mmol/L Na3 GTP 0,0418 g 0,4 Mmol/L Na Phosphokreatin 0,510 g 10 Mmol/L * niedrige Konzentration der Cl– für Miniatur-Aufnahmen Tabelle 4: Eine Rezept für eine intrazelluläre Lösung für Spannung Klemme Aufnahme Parameter ungeübte IA ausgebildet ungepaarte Spaziergang durch mEPSC amplitude Varianz 5.8 32.1 4.7 5.9 Standardabweichung 2.4 5.7 2.2 2.4 Variationskoeffizient 0.189 0.326 0,177 0.190 mIPSC amplitude Varianz 17.1 56,7 31,8 20,7 Standardabweichung 4.1 7.5 5.6 4.5 Variationskoeffizient 0.279 0.387 0,367 0.286 Tabelle 5: Die Vielfalt der Miniatur exzitatorischen und inhibitorischen postsynaptischen aktuelle (mEPSC und mIPSC) Amplituden in hemmenden Vermeidung (IA)-Ratten ausgebildet Parameter ungeübte IA ausgebildet ungepaarte Spaziergang durch mEPSC Frequenz Varianz 278 2195 188 195 Standardabweichung 17 47 14 14 Variationskoeffizient 0.902 1.198 0.893 0.874 mIPSC Frequenz Varianz 3282 27212 1385 5135 Standardabweichung 57 165 37 72 Variationskoeffizient 1,195 1,006 0.955 0.836 Tabelle 6: Die Vielfalt der Miniatur exzitatorischen und inhibitorischen postsynaptischen aktuelle (mEPSC und mIPSC) Frequenzen in hemmenden Vermeidung (IA)-Ratten ausgebildet