Slice Patch Clamp técnica para analizar la plasticidad inducida por el aprendizaje

todos los procedimientos quirúrgicos y alojamiento de los animales estaban de acuerdo con las directrices de animales experimentación de Yamaguchi University School of Medicine y fueron aprobados por el cuidado de Animal institucional y Comité uso de Yamaguchi Universidad. 1. animales Use 4 a 5 semanas de edad hombres ratas Sprague-Dawley (postnatales 28 a 31 días de edad). Casa de las ratas en jaulas individuales (40 cm x 25 cm x 25 cm) mantenidas a una temperatura constante (23 ° C ± de 1 ° C) en un ciclo de 12 h luz/oscuridad. Dar ratas acceso ad libitum a agua y alimentos. 2. Prueba de la barra de rotor investigar habilidad motor de aprendizaje, sujeto a cada rata para la prueba de la barra del rotor (diámetro de rod de 7 cm, ancho de carril 8,9 cm, altura de caída 26,7 cm) para 1 o 2 días consecutivos ( figura 1A en Kida et al., 2016 < sup clase = "xref" > 7). Realizar la tarea en una habitación tranquila, con control de temperatura (23 ± 1 ° C). No molestar ni manipule las ratas antes de la prueba Configurar la barra de rotor a modo de aceleración, que aumenta linealmente de 4 vueltas/min a 40 vueltas/min (8 π/min a 80 π/min) en 5 min. Colocar la rata en la varilla giratoria descansa. Confirmar que todos los miembros están en la barra de. Medir la latencia a la caída de la varilla giratoria para evaluar el rendimiento del motor. Permite a cada rata 10 intentos (ensayos) con intervalos de 30 s. Si la rata cae de la varilla giratoria, ajústelo en la barra otra vez después de un intervalo de 10-20 s. Sacrificio de la rata con una sobredosis de pentobarbital (400 mg/kg) 30 min después del juicio final. Ratas control se inyectan con la misma dosis de la anestesia en sus jaulas hogar. 3. Prueba de evitación inhibitoria para investigar el aprendizaje contextual, ratas del sujeto a una prueba de evitación inhibitoria (IA) ( figura 1 en Mitsushima et al., 2011, 2013 10 , 11) Evite cualquier experiencia episódica en el día del experimento, como el contacto con otros, cambios de jaula o de limpieza. Realizar la tarea en una habitación tranquila, con control de temperatura (23 ± 1 ° C). Nota: El aparato de entrenamiento IA es una caja de acrílico de dos cámaras (longitud 33 cm, ancho 58 cm, altura 33 cm). Tiene un encendido seguro y un choque oscuro que están separados por una puerta de la trampa ( figura 1). Colocar la rata en el lado seguro (lit) de la caja iluminada. Manejar la rata suavemente sin estrés. Esperar un a corto plazo (10 a 20 s) para aclimatarse a la rata para el medio ambiente. Abrir la puerta corredera para permitir que la rata entrar en el cuadro oscuro a voluntad. Medir la latencia (s) antes de que la rata entra en el nuevo lado oscuro de la caja. La latencia de la primera prueba representa la rata de ' rendimiento de s antes de entrenar. Después de la entrada en el lado oscuro, cierre la puerta y aplique un choque de pie eléctrica revuelto (2 s, 1.6 mA) mediante varillas de acero eléctricos en el piso de la caja. Permiten que las ratas de recorrido explorar el aparato de entrenamiento durante 1 minuto sin ser sorprendido. Casa ratas en una jaula iluminada choque durante varios días y de pronto darán el choque sin experiencias episódicas. Manejar suavemente sin destacar en ningún grupo. Mantener cada rata en la caja oscura para 10 s antes de volver a la jaula casa. En 30 min después del choque del pie, otra vez colocar la rata en el lado iluminado de la caja. Medir la latencia para entrar en el lado oscuro. Volver la rata en la jaula casa. En 60 minutos después del choque, sacrificar la rata con una sobredosis de pentobarbital (400 mg/kg). Manejar la rata suavemente e inyectar la anestesia por vía intraperitoneal. En las ratas control no entrenado, inyectar la anestesia en sus jaulas hogar sin la experiencia descrita. 4. Buffer de disección disolver cristales de 0,195 g NaH 2 PO 4-2 H 2 O, 0,188 g KCl, 0,074 g CaCl 2, 1,423 g MgCl 2-6 H 2 O y 12,579 g de cloruro de colina en agua ultrapura (900 mL a 950 mL) . Vea la tabla 1. Disolver cristales de ácido ascórbico de 2,340 g, sal del sodio de ácido pirúvico 0,342 g, 2,100 g NaHCO 3 y 4,500 g de glucosa. Agregar agua hasta 1000 mL. El rango de osmolalidad será entre 290 mOsm/L y 300 mOsm/L. osmolalidad de ajuste mediante la adición de agua ultrapura, si es en el rango de. De la burbuja la solución con 5% CO 2 95% O 2 gas mezcla a temperaturas frías durante 5 minutos antes de su uso. 5. Líquido cefalorraquídeo artificial (aCSF) disolver cristales de 0,186 g KCl, NaCl, de 6,700 g y 0,156 g NaH 2 PO 4-2 H 2 O en agua ultrapura (900 mL a 950 mL). Consulte la tabla 2. Burbuja con la mezcla de gas de 5 min. Disolver cristales de 1,800 g glucosa y 2,184 g NaHCO 3 y agregar entonces 4 mL MgCl 2 y 4 mL de CaCl 2 de 1 M stock soluciones. Agregar agua hasta 1000 mL. El rango de osmolalidad será entre 290 mOsm/L y 295 mOsm/L. osmolalidad de ajustar mediante la adición de agua ultrapura, si es en el rango de. La burbuja con el antes de la mezcla de gas usar. 6. Soluciones intracelulares para grabaciones de abrazadera de la corriente (cuadro 3), disolver 0,0746 g KCl, 6,089 g gluconato de K, g 0,476 HEPES, g 0,0456 EGTA y 500 μl MgCl 2 de 1 M stock solución en 180 mL de agua ultrapura (ajustar el pH a 7.2 con KOH). Añadir 0,4408 g Na 2 – ATP, g 0,0418 Na 3 – GTP y g 0,510 Na-fosfocreatina. Añadir agua a 200 mL y ajustar el pH a 7.35 con KOH. Ajustar la osmolalidad a alrededor de 290 mOsm/L de agua ultrapura. Tienda como alícuotas de 1 mL en el congelador (-30 ° C). Para grabaciones de abrazadera de tensión (tabla 4), disolver 5,244 g CsMeSO 3 g 0,672 CsCl, 0,476 g HEPES, g 0,0456 EGTA y 500 μl MgCl 2 de 1 M stock soluciones en 180 mL de agua ultrapura. Ajustar el pH a 7.2 con CsOH. Para las grabaciones de mEPSP y mIPSP, utilice concentración modificada de 5,814 g CsMeSO 3 y 0,252 g CsCl para ajustar el potencial de reversión de la GABA A receptor respuesta 11. Añadir 0,4408 g Na 2 – ATP, g 0,0418 Na 3 – GTP y g 0,510 Na-fosfocreatina. Añadir agua a 200 mL y ajustar el pH a 7.35 con CsOH. Ajustar la osmolalidad a alrededor de 290 mOsm/L de agua ultrapura. Tienda como alícuotas de 1 mL en el congelador (-30 ° C). 7. Preparación de la rebanada previo al sacrificio, enfriamiento de todas las herramientas de disección con hielo picado ( figura 2A). Añadir 500 mL de agua fría en el recipiente de hielo para aumentar la superficie de contacto. Este procedimiento fue descrito previamente 10 , 11 , 12. Nota: Las herramientas aquí son: tijeras grandes, tijeras de iris, una espátula, una micro espátula, pinzas, pinzas, un vaso de precipitados de 200 mL de acero inoxidable, una cuchilla para recortar, una jeringa de perfusión cardiaca 120 mL con buffer de disección con la mezcla de gases, de cerebro un tubo de silicona (20 cm) conectado a una aguja de calibre 18 aplanada, una etapa de disección del cerebro de acero inoxidable (espesor = 3 mm, φ = 12 cm) y una etapa de montaje para el vibratome (φ = 5 cm). Sacrificar la rata 30 minutos después de completar el paradigma conductual por anestesiar con sobredosis de pentobarbital (400 mg/kg peso corporal). Realizar la preparación corte rápidamente para asegurar que los cortes son tan saludables como posible 10 , 11 , 12. El cerebro extrProtocolo de actuación cumple todas las normas veterinarias de nuestra Universidad. Relleno de burbujas de una jeringa de 120 mL con tampón de disección fría (tabla 1) con 5% CO 2 95% O 2 gas mezcla. Eliminar las posibles burbujas de aire antes de la perfusión. Después de exponer el corazón, inserte la aguja en la parte posterior del ventrículo izquierdo. Transcardial de realizar la perfusión del cerebro manualmente con la jeringa. Las ratas más grandes requieren más tampón de disección para perfusión. Sumergir el cerebro con tampón de disección helada por 5 min burbuja el búfer continuamente durante la sumersión. Recortar la parte posterior del cerebro en un paralelo de ángulo en la orientación dendrítica de la región cortical de destino usando una hoja. Puesto que el cerebro es de pie en el escenario de la disección con el fondo del extremo cortado, el ángulo inicial determina el ángulo de todos los sectores posteriores del cerebro. Este paso es muy importante ( figura 2B). Un ángulo incorrecto puede cortar a través de las neuronas piramidales objetivo. Nota: Las herramientas aquí son: una cuchilla para corte de cerebro, un papel de filtro (φ = 10 cm), una etapa de disección del cerebro de acero inoxidable (espesor = 3 mm, φ = 12 cm), una espátula, un pegamento, un gotero y una etapa de montaje para el vibratome (φ = 5 cm). Corte rebanadas de cerebro coronales gruesa 350 μm con un vibratome. Llenar la sala de disección con tampón helada burbujas con 5% CO 2 95% O 2 gas mezcla ( figura 2). El búfer de burbuja continuamente durante la rebanada del cerebro. Recortar la periferia de la zona de destino con unas tijeras de iris. Lavado las rodajas cortadas en temperatura ambiente aCSF burbujearon con 5% CO 2 / 95% de O 2 (tabla 2). Rodajas de mantener la recortada en una cámara de interfaz hasta que la grabación está realizan ( Figura 2D y E). Incubación durante 1 hora en la cámara mejora la condición de las células, pero los fenotipos cambian si los cortes se incuban durante más de 10 horas. Cierre la tapa de la cámara para encerrar los gases y el líquido en pequeñas gotas de aCSF. 8. Abrazadera del remiendo de celulares Nota: grabaciones de celulares requieren un amplificador y un filtro de paso bajo que se establece en una frecuencia de corte de 5 kHz. Las señales son digitalizadas y almacenadas en un PC. Se analizan los datos almacenados fuera de línea ( Figura 3A). Crear electrodos de vidrio utilizando un extractor horizontal. Llenar los electrodos con una solución adecuada (tablas 3 y 4) utilizando una jeringa de 1 mL de polietileno normal conectado a un tubo de cristal fino y un filtro de 0,22 μm. Antes del contacto con la célula, mantener presión positiva y ajustar la corriente a cero pipeta. Después formando un gigaohm, aplicar presión negativa a la ruptura de la membrana de la célula (célula entera configuración figura 3F). 9. Análisis de la abrazadera de la corriente propiedades de la membrana celular llenan el parche grabación pipetas con la solución intracelular para grabaciones de abrazadera de la corriente (cuadro 3). La resistencia de la pipeta es entre MΩ 4 y 7 MΩ en la aCSF. Después de rupturas de la membrana, mantener la tensión de la membrana a -60 mV en modo V-CLAMP. Luego, cambiar de " baño " modo a " celular " modo en la prueba de la membrana utilizando el software para medir las propiedades intrínsecas de la célula como la capacitancia de la membrana, la resistencia y la constante de tiempo. Estudio de inyección actual después de registrar las propiedades intrínsecas de la célula, cambia el modo de V-CLAMP a pista (I = 0) /I-CLAMP NORMAL para la inyección actual. Tenga en cuenta que el potencial de Unión líquida no debe ser corregido 10. Inyectar corriente en la célula para la Sra. 300 cambia la intensidad de la corriente de paso a paso de − 100 pA a pA +550 con aumentos de 50 pA. Contar el número de espigas (potenciales de acción) sacados por las inyecciones actuales. Medir la tensión mínima necesaria para provocar un potencial de acción (esto es el voltaje de umbral). Calcular la amplitud de afterhyperpolarization como la diferencia entre la tensión en la iniciación de la espiga y el voltaje más bajo alcanzado durante el afterhyperpolarization 7. 10. Análisis de abrazadera de tensión AMPA/NMDA la relación Nota: relación de la AMPA/NMDA es una forma convencional de evaluar postsináptico plasticidad glutamatérgica sinapsis excitatorias 7 , 8 , 9 , 10 , 11. sin embargo, tenga en cuenta que aumentos concomitantes en ambos componentes no pueden cambiar el cociente 13. Perfuse la sala de grabación con solución fisiológica burbujeada con la mezcla de gases y mantener la temperatura a 22 ° C a 25 picrotoxin de 0.1mm ° C. Agregue a la solución para bloquear el GABA A – respuesta mediada por y añadir 4 μm 2- chloroadenosine para estabilizar la respuesta neural evocada 14. Llenar el parche pipetas con la solución intracelular para abrazadera de tensión de grabación grabaciones (tabla 4). Comprobar la resistencia de la pipeta de la grabación en la aCSF. La resistencia está entre MΩ 4 y 7 MΩ. Para la grabación en neuronas piramidales de capa II/III en el M1, coloque un tungsteno bipolar estimular electrodo 200 μm a 300 μm lateral a las células a ser grabado, debajo de la superficie pial de la región de la representación del miembro anterior (2 mm lateral a la de la línea media) 15 , 16 , 17. Para la grabación en una neurona piramidal CA1, coloque el estimulante electrodo 200 μm a 300 μm lateral (fibra colateral de Schaffer) o medial (vía temporoammonic) a las células que va a ser grabado ( figura 3B). Aumentar la intensidad del estímulo hasta la respuesta sináptica > 10 pa. Calcular el cociente NMDA/AMPA como el cociente de la corriente máxima medida en − 60 mV a la corriente medida a + 40 mV en 150 ms después del inicio del estímulo. Tenga en cuenta que rastros de 50 a 100 deben promediarse para calcular el cociente de. Grabaciones actuales postsinápticas miniatura Nota: corrientes postsinápticas excitatorias de miniatura (mEPSCs) se cree que corresponden a las respuestas que se produce por la liberación presináptica de una sola vesícula de glutamato 18 . Por el contrario, corrientes postsinápticas inhibitorios de miniatura (mIPSCs) se cree que corresponden a las respuestas que se produce por la liberación presináptica de una sola vesícula de GABA 18. Aumento en las amplitudes de mEPSCs y mIPSCs refleja la transmisión postsináptica fortalecimiento, mientras que aumenta en el caso de frecuencia reflejan aumentos en el número de sinapsis funcionales o la probabilidad de liberación presináptica 11 . Llene la pipeta de la grabación de parche con solución intracelular modificado (cuadro 4) para ajustar el potencial de reversión de la corriente mediada por el receptor GABA A -60 mV. Tetrodotoxin de agregar 0.5 μm al baño para bloquear los potenciales de acción espontáneos. Mantener la tensión a -60 mV a rECORD los acontecimientos mEPSC por 5 min Cambio la explotación potencial de 0 mV a mIPSC registro de eventos durante 5 minutos. Ya que las neuronas de M1 inversión ligeramente superior potencial de corrientes mediada por receptor AMPA, las mIPSCs de las neuronas de M1 se registran entre + 15 mV con APV de 0,1 mM. Espere unos minutos para estabilizar la corriente. Registrar los eventos de mIPSC de 5 min. Detectar los eventos de la miniatura con el software y utilizar eventos sobre 10 pA para el análisis. Contar el número de eventos mEPSCs o mIPSCs por 5 min determinar la frecuencia. Promedio de las amplitudes de los eventos para obtener la amplitud media. Confirmar si tratamiento de baño con el μm 10 CNQX o con 10 μm bicuculina metiodida bloquea los eventos mEPSCs y mIPSCs, respectivamente. Análisis de Paired-pulso Nota: plasticidad presináptica puede ser analizada mediante análisis de junto-pulso. Un aumento en la frecuencia del pulso apareado sugiere una disminución en el presynaptic glutamato o GABA liberar probabilidad 7 , 10 , 11. Analizar las sinapsis excitatorias, añadir picrotoxin 0,1 mM y registrar la respuesta a -60 mV. Aunque hemos añadido 4 μm 2-chloroadenosine para el baño, tenemos que tener en cuenta que la droga afecta a la probabilidad de liberación presináptica 14. Analizar las sinapsis inhibitorias, Añadir 0,1 mM APV y 4 μm 2-chloroadenosine para el baño y grabar la respuesta a 0 mV. En las neuronas de M1, registrar la respuesta en + 15 mV. Aplicar pulsos pareados con un intervalo inter-estímulo de ms de 100 o 200 ms. Registrar rastros alternativamente 50 a 100 a cada uno potencial y promedio de los valores. Calcular el cociente de pulso sincronizado como la relación entre el segundo pico en el primer pico de la corriente postsináptica.