פרוסה תיקון קלאמפ טכניקת ניתוח הנוצרות על-ידי למידה פלסטיות

דיור בעלי חיים וכל הניתוחים היו בהתאם להנחיות עבור בעלי חיים לניסויים של יאמאגוצ’י מהפקולטה לרפואה באוניברסיטה, אושרו על ידי טיפול בעלי חיים מוסדיים ועל שימוש הוועדה של יאמאגוצ’י אוניברסיטת. 1. חיות להשתמש כדי 5 בשבוע-בת 4 זכר חולדות ספראג-Dawley (כמחנכת 28 עד 31 ימים של גיל). בית העכברושים בכלובים פלסטיק בודדות (40 ס”מ × 25 ס”מ × 25 ס מ) נשמר בטמפרטורה קבועה (23 ° C ± 1 ° C) תחת מחזור/כהה 12-h. לתת חולדות ad libitum גישה מים ומזון. 2. הרוטור רוד מבחן לחקור את יכולות מוטוריות למידה, נושא כל עכברוש במבחן רוד הרוטור (רוד בקוטר 7 ס מ; רוחב ליין 8.9 ס”מ; גובה הנפילה 26.7 ס מ) 1 או 2 ימים רצופים ( איור 1A קידה ואח ‘, 2016 7). לבצע את הפעילות בחדר שקט, בטמפרטורה מבוקרת (23 ± 1 ° C). לא להפריע או להתמודד עם חולדות לפני ילדי הגדר את המוט הרוטור למצב האצה, אשר מגדילה בצורה לינארית מ- 4 סיבובים לדקה כדי 40 סיבובים לדקה (8 π/דקה כדי π 80/min) ב- 5 דק לשים את החולדה על מוט סיבוב מנוחתו. לאשר כי כל האיברים הם על המוט. למדוד ההשהיה ליפול מהעגלה מוט סיבוב כדי להעריך את ביצועי המנוע. לאפשר כל עכברוש 10 ניסיונות (ניסויים) עם מרווחי 30-s. אם החולדה נופל מן המטה מסתובב, להגדיר אותו על המוט שוב לאחר מרווח s 10-20- להקריב את העכברוש עם מנת יתר של פנטוברביטל (400 מ”ג/ק”ג) 30 דקות אחרי המשפט האחרון. להזריק שליטה מאומנת חולדות עם המינון אותו הרדמה בכלובים שלהם הביתה. 3. מבחן הימנעות מעכבות לחקור את לימוד הקשרי, נושא חולדות כדי מבחן הימנעות מעכבות (IA) ( איור 1D ב Mitsushima et al., 2011 2013 10 , 11) למנוע כל חוויות אפיזודי ביום של הניסוי כגון קשר עם אחרים, שינויים כלוב או ניקוי. לבצע את המשימה בחדר שקט, בטמפרטורה מבוקרת (23 ± 1 ° C). הערה: המנגנון הכשרה IA היא תיבה אקרילי דו תאיים (אורך 33 ס מ; רוחב 58 ס”מ; גובה 33 ס מ). יש בו צד בטוח מואר צד אפל הלם המופרדים באמצעות דלת נסתרת ( איור 1D). מקום העכברוש ליתר (ספרות) של תיבת מואר. להתמודד עם העכברוש בעדינות בלי לחץ. לחכות זמן קצר (10-20 s) להסתגלות העכברוש לסביבה. לפתוח את הדלת האחורית כדי לאפשר את החולדה להזין בתיבת כהה יהיה. למדוד ההשהיה (s) לפני החולדה חודר את הצד האפל הרומן של התיבה. ההשהיה של המשפט הראשון מייצג את העכברוש ' s ביצועים לפני אימון- לאחר כניסתו הצד האפל, סגור את הדלת ולהחיל הלם מעורבל רגליים חשמלי (2 s, 1.6 mA) באמצעות מוטות פלדה חשמל הממוקם בתוך הרצפה של התיבה. לאפשר חולדות שלב אחר שלב לחקור את המנגנון הדרכה עבור 1 דקות מבלי להיות בהלם. בית אינטראקצית חולדות בכלוב הלם מואר עבור מספר ימים פתאום נותן ההלם ללא חוויות אפיזודי. לטפל בעדינות ללא מתח בקבוצות כל. לשמור כל עכברוש בתיבת כהה עבור 10 s לפני שחזר זה הכלוב הביתה. -30 דקות לאחר ההלם רגל, למקם שוב העכברוש לתוך הצד המואר של התיבה. למדוד את ההשהיה כדי להזין את הצד האפל. להחזיר את החולדה לכלוב הביתה. -60 דקות לאחר ההלם, להקריב את העכברוש עם מנת יתר של פנטוברביטל (400 מ”ג/ק”ג). להתמודד עם העכברוש בעדינות ולהזריק את ההרדמה intraperitoneally. בחולדות שליטה מיומנת, להזריק את ההרדמה בכלובים שלהם הביתה בלי החוויה המתוארת לעיל. 4. מאגר דיסקציה להמיס גבישים של 0.195 g 2 PO NaH 4-2 H 2 O, g 0.188 אשלגן כלורי, CaCl 0.074 g 2, 1.423 g MgCl 2-6 H 2 O ו- 12.579 g כולין כלוריד במים הנדסה גנטית (900 מ”ל עד 950 מ”ל) . ראה טבלה 1- להמיס גבישים של חומצה אסקורבית 2.340 g, 0.342 g פירובט נתרן מלח, 2.100 g NaHCO 3 ו- 4.500 g גלוקוז. הוסף מים עד 1000 מ”ל. טווח osmolality יהיה בין mOsm 290/L ל 300 mOsm/ל’ התאם osmolality על-ידי הוספת מים הנדסה גנטית, אם זה על פני הטווח. בועה הפתרון ב- 5% CO 2 / 95% O 2 גז התערובת בטמפרטורה קרה כקרח במשך 5 דקות לפני השימוש. 5. נוזל מוחי שדרתי מלאכותי (כלנית חדד) להמיס גבישים של 0.186 g. אשלגן כלורי, 6.700 g NaCl, ו- g 0.156 NaH 2 PO 4-2 H 2 O במים הנדסה גנטית (900 מ”ל עד 950 מ”ל). ראה טבלה 2- בועה עם תערובת גז עבור 5 דק. להמיס גבישים של 1.800 g גלוקוז ו- 2.184 g NaHCO 3 ולאחר מכן להוסיף 4 מ”ל MgCl 2 ו- 4 מ”ל CaCl 2 מ- 1 מ’ במניה פתרונות. הוסף מים עד 1000 מ”ל. טווח osmolality יהיה בין mOsm 290/L ו- 295 mOsm/ל’ התאם osmolality על-ידי הוספת מים הנדסה גנטית, אם זה על פני הטווח. בועה עם ראש המנזר תערובת גז להשתמש. 6. פתרונות תאיים עבור זרם-קלאמפ הקלטות (טבלה 3), התמוססות 0.0746 גרם אשלגן כלורי, 6.089 g K-gluconate, 0.476 g HEPES, 0.0456 g EGTA ו- 500 MgCl µL 2 מ- 1 מ’ במניה הפתרון ב 180 מ ל מים הנדסה גנטית (להתאים את ה-pH ל 7.2 עם קו). להוסיף 0.4408 g נה 2 – ATP, 0.0418 g נה 3 – GTP ו 0.510 g נה-phosphocreatine. להוסיף מים עד 200 מ”ל ולהתאים את ה-pH 7.35 עם קו כדי. להתאים את osmolality כדי mOsm בסביבות 290/L על-ידי הוספת מים אלקטרופורזה. חנות כמו 1-mL aliquots במקפיא (למינוס 30 מעלות). עבור מתח-קלאמפ הקלטות (טבלה 4), לפזר 5.244 g CsMeSO 3, 0.672 g. CsCl, 0.476 g HEPES, 0.0456 g EGTA ו- 500 MgCl µL 2 מ- 1 מ’ במניה פתרונות ב- 180 מ ל מים הנדסה גנטית. להתאים את ה-pH ל 7.2 עם CsOH. להקלטות mEPSP ו- mIPSP, להשתמש ריכוז שונה של 5.814 g CsMeSO 3 ו- 0.252 g CsCl כדי להתאים את פוטנציאל היפוך של התגובה קולטן GABA A 11. להוסיף 0.4408 g נה 2 – ATP, 0.0418 g נה 3 – GTP ו 0.510 g נה-phosphocreatine. להוסיף מים עד 200 מ”ל ולהתאים את ה-pH ל 7.35 עם CsOH. להתאים את osmolality כדי mOsm בסביבות 290/L על-ידי הוספת מים אלקטרופורזה. חנות כמו 1-mL aliquots במקפיא (למינוס 30 מעלות). 7. פורסים הכנה מראש כדי להקריב, לרמתו כל כלי חיתוך עם קרח כתוש ( איור 2 א). להוסיף בערך 500 מ”ל של מים קרים לתוך המיכל קרח כתוש כדי להגדיל את שטח הפנים ליצירת קשר. פרוצדורה זו תוארה בעבר 10 , 11 , 12- הערה: הכלים כאן הם: מספריים גדולים, מספריים איריס, מרית, מרית מיקרו, מלקחיים, פינצטה, גביע 200-mL פלדת אל-חלד, להב עבור המוח זמירה, מזרק 120-mL זלוף הלב מלא מאגר לנתיחה מטופלים עם תערובת גז, צינור סיליקון (20 ס מ) מחובר מחט אל תדאגי שעברו שיטוח, שלב ניתוח המוח אל חלד (עובי = 3 מ מ, ϕ = 12 ס מ), ואת במת הרכבה vibratome (ϕ = 5 ס מ). להקריב את החולדה 30 דקות לאחר השלמת הדפוס ההתנהגותי מאת מאלחש זה עם מנת יתר של פנטוברביטל (400 מ”ג/ק”ג משקל גוף). מבצעים בתכשיר פרוסה במהירות כדי להבטיח כי הפרוסות בריאה כמו אפשרי 10 , 11 , 12. תוספת המוחפרוטוקול פעולה עומד בכל הסטנדרטים וטרינרית של האוניברסיטה שלנו. מילוי מזרק 120-mL עם המאגר הקר לנתיחה (טבלה 1) מבעבע עם 5% CO 2 / 95% O 2 גז תערובת. להסיר את כל הבועות אוויר לפני זלוף. לאחר שחשף את הלב, את המחט לתוך החלק האחורי של החדר השמאלי. בצע זלוף transcardial של המוח באופן ידני באמצעות המזרק. חולדות גדולות יותר לדרוש עוד מאגר לנתיחה זלוף. להטביע את המוח עם ניתוח קר כקרח המאגר עבור 5 דק בועה המאגר באופן רציף במהלך ועלייתו. חתוך אל הצד האחורי של המוח ב במקביל זווית הכיוון דנדריטים של אזור בקליפת המוח היעד באמצעות סכין. מאז המוח היא לעמוד על הבמה הקרע עם חיתוך קצה התחתון, הזווית הראשוני קובע את זווית כל פרוסות המוח עוקבות. השלב זה חשוב באופן קריטי ( איור 2B). זווית שגוי עשוי לחתוך הנוירונים כפירמידה היעד. הערה: הכלים כאן הם: להב עבור המוח זמירה, נייר סינון (ϕ = 10 ס מ), שלב ניתוח המוח אל חלד (עובי = 3 מ מ, ϕ = 12 ס מ), מרית, עם דבק מגע, טפי ואת במת הרכבה vibratome (ϕ = 5 ס מ). לחתוך פרוסות עבות המוח הילתית באמצעות vibratome של 350-מיקרומטר. מילוי החדר ניתוח עם המאגר הקר מבעבע עם 5% CO 2 / 95% O 2 גז תערובת ( איור 2C). בועה המאגר באופן רציף במהלך הפרוסה במוח. לקצץ הפריפריה של אזור היעד באמצעות מספריים איריס. לשטוף פרוסות החתוך בעדינות בטמפרטורת החדר חנה המבר מבעבע עם 5% CO 2 / 95% O 2 (טבלה 2). פרוסות תחזוקה גזוז תא ממשק עד בהקלטה שבוצעה ( איור 2D ו- E). הדגירה לשעה בבית הבליעה משפר את המצב של התאים, אך הפנוטיפים לשנות אם הפרוסות מודגרת למשך יותר מעשר שעות. סגור את המכסה של תא כדי להקיף את הגזים וטיפות הנוזל קטן של חנה המבר. 8. מלחציים תיקון שלם-תא הערה: כל תא הקלטות דורשים מגבר מסנן נמוך לעבור מוגדר על תדר הקיצוץ של 5 קילו-הרץ. האותות דיגיטציה ומאוחסנים במחשב. ניתוח הנתונים המאוחסנים מנותק ( איור 3 א). צור זכוכית אלקטרודות באמצעות של פולר אופקי. למלא את האלקטרודות פתרון מתאים (טבלאות 3 ו- 4) בעזרת מזרק 1-mL פוליאתילן רגיל מחובר צינור זכוכית ומסנן 0.22-מיקרומטר. לפני מגע עם התא, לשמור על לחץ אוויר חיובי ולהתאים את פיפטה הנוכחי לאפס. לאחר ויוצרים גושפנקה ג’יגה אוהם, הפעילו לחץ שלילי להיקרע קרום התא (תא כל תצורה באיור 3F). 9. ניתוח הנוכחי-קלאמפ המאפיינים של קרום התא למלא את התיקון הקלטה פיפטות עם הפתרון תאיים להקלטות הנוכחי-קלאמפ (טבלה 3). ההתנגדות של פיפטה היא בין 4 MΩ 7 MΩ ב חנה המבר. אחרי הקרום ציסטות נקרעות, להחזיק את מתח הממברנה ב-60 mV במצב V-קלאמפ. לאחר מכן, מעבר " אמבט " למצב " תא " מצב במבחן ממברנה שימוש בתוכנה כדי למדוד את המאפיינים תאים פנימיים כגון קיבול הממברנה, התנגדות קבוע הזמן. הנוכחי המחקר זריקה לאחר הקלטת המאפיינים תאים פנימיים, לעבור למצב של V-קלאמפ כדי לעקוב אחר (אני = 0) /I-CLAMP רגיל עבור הזריקה הנוכחית. שימו לב כי הפוטנציאל צומת נוזלי לא צריך להיות מתוקן 10. הכנס הנוכחי לתוך התא עבור גברת 300 לשנות את עוצמת הזרם stepwise מ − 100 הרשות הפלסטינית +550 עם עליות 50-pA. לספור את מספר קוצים (פוטנציאל פעולה) שהפיק את הזריקות הנוכחי. למדוד את המתח המינימלי הדרוש כדי לגרום של פוטנציאל הפעולה (זהו מתח הסף). לחשב את משרעת afterhyperpolarization כמו ההבדל בין המתח על ספייק חניכה המתח הנמוך ביותר השיגו במהלך afterhyperpolarization 7. 10. . מלחציים צולבים מתח ניתוח אמפא/NMDA יחס הערה: יחס אמפא/NMDA הוא דרך מקובלת להעריך פלסטיות postsynaptic glutamatergic הסינפסות סינאפסות 7 , 8 , 9 , 10 , 11. עם זאת, שים לב והמצוות העלאות שני הרכיבים אינם יכולים לשנות את יחס 13. Perfuse תא הקלטה עם פתרון פיזיולוגיים מבעבע עם תערובת גז ולשמור על הטמפרטורה ב 22 ° C עד 25 מעלות צלזיוס, הוסף 0.1 מ מ picrotoxin אל הפתרון כדי לחסום את GABA A – מתווכת התגובה ולהוסיף 4 מיקרומטר 2- chloroadenosine כדי לייצב את התגובה העצבית עורר 14. למלא את התיקון הקלטה פיפטות עם הפתרון תאיים על מתח-קלאמפ הקלטות (טבלה 4). לבדוק את עמידות פיפטה הקלטה ב חנה המבר. ההתנגדות היא בין 4 MΩ 7 MΩ. בשביל ההקלטה בנוירונים שכבה II/III כפירמידה ב M1, מקום של טונגסטן דו קוטבית מגרה מיקרומטר אלקטרודה 200 עד 300 לרוחב מיקרומטר לתאים כדי שיירשמו, מתחת לפני השטח pial באזור של הייצוג forelimb (2-מ מ לרוחב קו האמצע) 15 , 16 , 17. בשביל ההקלטה בנוירון כפירמידה CA1, מקום מגרה את האלקטרודה 200 מיקרומטר, כדי מיקרומטר 300 לרוחב (סיבים משני שפר) או המדיאלי (מסלול temporoammonic) על התאים יהיה מוקלט ( איור 3B). להגדיל את עוצמת הגירוי עד התגובה סינפטית > 10 אבא לחשב את יחס אמפא/NMDA הנמדדת היחס השיא הנוכחי ב − 60 mV הנוכחי נמדד ב +40 mV ב-150 מילישניות לאחר תחילת גירוי. שימו לב כי עקבות 50 ל- 100 צריך להיות בממוצע כדי לחשב את היחס. הקלטות הנוכחי postsynaptic מיניאטורי הערה: מיניאטורה זרמי postsynaptic מעוררים (mEPSCs) נחשבים כדי שיתאימו התגובות שהפיק לשחרור שלפוחית יחיד של גלוטמט presynaptic 18 . לעומת זאת, מיניאטורות זרמי postsynaptic מעכבות (mIPSCs) נחשבים כדי שיתאימו התגובות שהפיק לשחרור שלפוחית יחיד של גאבא 18 presynaptic. העלאות amplitudes של mEPSCs ו- mIPSCs משקפת שידור postsynaptic חיזוק, תוך עליות במקרה תדירות משקפים עליות מספר הסינפסות תפקודית או את ההסתברות לשחרור presynaptic 11 . למלא פיפטה הקלטה של תיקון עם פתרון שונה תאיים (טבלה 4) כדי להתאים את פוטנציאל ההיפוך של הזרם בתיווך קולטן GABA A ל-60 mV. הוסף 0.5 מיקרומטר טטרודוטוקסין לאמבטיה כדי לחסום את פוטנציאל פעולה ספונטנית. להחזיק המתח ב-60 mV ל record האירועים mEPSC עבור 5 דק MV שינוי החזקת פוטנציאליים 0 mIPSC שיא אירועים במשך 5 דקות. כי נוירונים M1 הראו היפוך מעט גבוה יותר פוטנציאל אמפא קולטן בתיווך זרמים, mIPSCs של נוירונים M1 נרשמים ב +15 mV עם 0.1 מ”מ APV. לחכות כמה דקות על הזרם לייצב. להקליט את האירועים mIPSC עבור 5 דק. לזהות את האירועים מיניאטורי שימוש בתוכנה, והשתמש אירועים מעל הרשות הפלסטינית 10 לניתוח. לספור את מספר אירועים mEPSCs או mIPSCs עבור 5 דקות כדי לקבוע את התדירות. ממוצע amplitudes את האירועים כדי להשיג את משרעת רשע. לאשר האם לערוך טיפול באמבט עם 10 מיקרומטר CNQX או עם 10 מיקרומטר bicuculline methiodide חוסם האירועים mEPSCs ו- mIPSCs, בהתאמה. ניתוח מדגמים מזווגים-הדופק הערה: פלסטיות Presynaptic ניתן לנתח באמצעות ניתוח לזווג…-דופק. עלייה לזווג-הדופק מצביע על ירידה גלוטמט presynaptic או GABA לשחרר את ההסתברות 7 , 10 , 11. כדי לנתח את הסינפסות סינאפסות, להוסיף picrotoxin 0.1 מ מ ולהקליט את התגובה ב-60 mV. למרות הוספנו 2 מיקרומטר 4-chloroadenosine לאמבטיה, עלינו לזכור כי התרופה משפיעה על הסתברות השחרור presynaptic 14- לנתח הסינפסות מעכבות, להוסיף 0.1 מ מ APV ו 2 מיקרומטר 4-chloroadenosine לאמבטיה ולהקליט את התגובה ב 0 mV. בנוירונים M1, להקליט את התגובות +15 mV. החלת פולסים לזווג במרווח הבין-גירוי של 100 ms או 200 גב ממוצע של הערכים ולהקליט 50-100 עקבות רציפים בכל אחד מחזיק פוטנציאלי. לחשב את יחס הדופק לזווג כיחס בין הפסגה השנייה לשיא הראשון של הזרם postsynaptic.