Sezione tecnica del Patch Clamp per l'analisi di plasticità indotta su apprendimento

Come abbiamo descritto recentemente7, formazione di asta di rotore (Figura 1A) ha indotto cambiamenti dinamici nella plasticità intrinseca dei neuroni piramidali M1 strato II/III. Misurare la latenza fino a quando i ratti cadono dallo stelo rotante permette di stimare le prestazioni di apprendimento specializzato del ratto. Latenza più lunga indica la migliore prestazione del motore. Il giorno 1 della formazione, i ratti migliorato le loro prestazioni di asta di rotore fino a quando il processo si concluse. Il giorno 2, i ratti hanno raggiunto livelli quasi asintotica nella sessione media punteggi (Figura 1B). Confrontato con la latenza al primo processo, analisi post-hoc ha mostrato miglioramenti significativi alle prove finali nei giorni di allenamento (Figura 1). Figura 4A Mostra un esempio di analisi corrente-morsetto in cui modificare le proprietà di un neurone dopo l’apprendimento di capacità motorie. Iniezioni di pA 400 e 500 pA correnti sono stati necessari per indurre i potenziali di azione del gruppo inesperto e nei ratti addestrati 1-giorno, rispettivamente. Al contrario, l’iniezione di solo un 150 pA corrente era sufficiente per elicitare potenziali d’azione nei ratti addestrati 2 giorni. Il rapporto tra l’intensità di corrente e il numero di potenziali di azione è mostrato in Figura 4B. Appena 50 pA corrente era sufficiente a suscitare picchi in ratti addestrati 2 giorni; al contrario, ratti addestrati 1 giorno ha risposto con meno potenziali di azione che i ratti non addestrati a 350 pA e correnti più elevate. Inoltre, la Figura 4 Mostra che 1 giorno addestrati ratti hanno mostrato che riposa inferiore potenziali, spike superiore soglia e afterhyperpolarization più profondo, mentre ratti addestrati 2 giorni hanno mostrato il più alto potenziale di riposo (Figura 4) e la resistenza della membrana ( Figura 4). Come abbiamo descritto in precedenza11, formazione di IA (Figura 1) indotta postsinaptica plasticità alle sinapsi eccitatorie ed inibitorie dei neuroni hippocampal CA1. Misurando la latenza nel light box, abbiamo potuto stimare le prestazioni di apprendimento contestuale del ratto. Figura 1E Mostra i risultati dell’attività IA. Dopo la scossa elettrica accoppiata, i ratti imparano a evitare il lato oscuro della scatola e stare nel lato illuminato, che solitamente non preferirebbero. La tendenza ad evitare il lato oscuro di conseguenza indica l’acquisizione di ricordi contestuali. Figura 5 Mostra un esempio di analisi di tensione-morsetto in cui miniatura correnti postsinaptiche sono state cambiate drammaticamente dopo l’apprendimento contestuale. Per studiare la plasticità indotta su apprendimento, mIPSCs AMPA-mediata spontanea e GABAA-mediata mEPSCs sono stati registrati sequenzialmente in presenza della tetrodotossina di 0,5 µM (Figura 5A e B). Come mostrato su appezzamenti bidimensionale (Figura 5), ogni neurone di CA1 ha avuto diverse ampiezze medie per mIPSCs e mEPSCs. Anche se le ampiezze basse, hanno mostrato una gamma stretta distribuzione in inesperto, spaiati, e ratti walk-through, quelli erano diversi in ratti addestrati IA (tabella 5). ANOVA seguita da analisi post-hoc ha mostrato un aumento significativo in medie ampiezze delle mEPSC e mIPSC in ratti addestrati IA (Figura 5E), suggerendo la plasticità postsinaptica apprendimento-indotta nei neuroni CA1. Inoltre, ogni neurone di CA1 esposto diverse frequenze mEPSC e mIPSC (Figura 5). Anche se le frequenze basse, hanno mostrato una gamma stretta distribuzione in inesperto, spaiati, e ratti walk-through, quelli erano diversi in ratti addestrati IA (tabella 6). ANOVA seguita da analisi post-hoc ha mostrato un aumento significativo delle frequenze degli eventi mEPSC e mIPSC in ratti addestrati IA (Figura 5F). Ci sono due possibili interpretazioni di questi risultati. Il primo è che l’apprendimento contestuale aumentato il numero delle sinapsi funzionali dei neuroni. L’altro è che l’apprendimento contestuale aumentato la probabilità di rilascio presinaptico del glutammato e GABA. Per più ulteriormente esaminare plasticità presinaptica, abbiamo anche condotto accoppiare-impulso stimolazioni, come riferito precedentemente10,11. Figura 1 : Apprendimento di prestazioni dopo l’allenamento. A: il disegno sperimentale spettacoli il rotore asta formazione e sezione coronale del cervello. B: la latenza media di cadere dalla canna asta rotore accelerare. C: la latenza media incrostata l’asta sul primo e le prove finali sulla formazione giorni 1 e 27. P< 0.01 vs prima prova. D: Schema della sezione di cervello inibitorio dell’evitare (IA) attività e coronale. E: la latenza media per entrare nella scatola scura prima e dopo IA formazione11. P< 0.01 vs prima dell’allenamento di IA. I numeri dalle sezioni coronali indicano la distanza anteriore il bregma in mm. Il numero di animali è mostrato nella parte inferiore delle barre. Barre di errore indicano SEM. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura. Figura 2 : Affettare procedure. A: le fotografie mostrano la preparazione di fettine di cervello acuto. Gli strumenti di dissezione sono stati raffreddati in prima di ghiaccio tritato di usarla. B: dissezione e rifilatura del cervello. Si noti che l’angolo di taglio sul lato posteriore deve essere orientato in parallelo con l’orientamento dendritica. C: affettare il cervello in una camera del vibratome. Il cervello è bagnato nel buffer di dissezione e gorgogliare continuamente con una miscela di gas2 di 95% O di 5% CO2. D: una camera di interfaccia è costituito da due contenitori di plastica per alimenti e un tubo di silicone. La camera era pieni di liquido Cerebrospinale artificiale e gorgogliare continuamente con la miscela di gas. E: fettine di cervello sono stati collocati su carta da filtro bagnato nell’alloggiamento.Bar = 5 mm. per favore clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura. Figura 3 : Procedure di Patch clamp. A: il sistema di patch-clamp utilizzato per registrare i segnali elettrici da un neurone. La posizione della stimolante ed elettrodi di registrazione nei neuroni di II/III livello sono mostrati nella corteccia di motore del ratto. B: per analizzare le Schaffer sinapsi di un neurone piramidale CA1, un elettrodo stimolante è stato messo alla strato radiato. Per analizzare le sinapsi temporoammonic, fu collocato un elettrodo stimolante la strato molecolare. Rappresentante tracce di AMPA evocato e correnti postsinaptiche eccitatorie mediata dal recettore NMDA nel stesso neurone CA1 sono mostrate. C: una fetta di ancoraggio è stato utilizzato per stabilizzare la fetta nella camera di registrazione. D: una mappa di rappresentazione nella corteccia motoria, basata sulle carte pubblicate15,16,17. ML = del midline. E: Neuroni II/III prima di strato micrografie IR-DIC della M1 (superiore) e durante la registrazione (inferiore). Bar = 10 µm. F: cambiamenti nella pipetta corrente prima tocco (parte superiore) ed alla rottura della membrana (infondo). Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura. Figura 4 : Risultati rappresentativi di analisi corrente-morsetto7 . A: tracce rappresentative dei potenziali d’azione registrata dopo induzione con iniezioni di corrente. B: relazioni tra l’ingresso di corrente media (pA) vs azione potenziale uscita (numero di picchi) nelle fette del cervello da inesperto (bar aperto), 1-giorno addestrate (barre grigie) e 2 giorni ratti addestrati (riempito bar). C: afterhyperpolarization dei neuroni II/III livello, soglia e potenziale di riposo. D: resistenza di membrana e resistenza in serie dei neuroni. Abbiamo usato il 9-10 ratti in ogni gruppo. Il numero di celle viene visualizzato all’interno di ogni barra. Barre di errore indicano SEM. *P< 0.05, * *P< 0.01 vs non addestrati. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura. Figura 5 : Risultati rappresentativi delle analisi tensione-morsetto11 .Rappresentante tracce di miniatura eccitatorie ed inibitorie correnti postsinaptiche (mIPSCs e mEPSCs) di inesperto (A) e inibitorio dell’evitare (IA)-addestrato ratti (B). mIPSCs a-60 mV e mEPSCs a 0 mV sono stati misurati in sequenza nel stesso neurone piramidale CA1 in presenza di tetrodotossina (0,5 µM). Barra verticale = 20 pA, barra orizzontale = 200 msec. C: terreni bidimensionale della media mE (I) PSC ampiezze in inesperto, IA-addestrato, spaiati e walk-through ratti. D: grafici bidimensionali di mE (I) PSC frequenze nei 4 gruppi. Nota che ogni neurone CA1 esposte diverse significa mE (I) frequenze e ampiezze PSC. Formazione di IA non solo ha rafforzato le ampiezze medie (E), ma anche aumentato le frequenze di mE (I) eventi PSC (F). Abbiamo usato 4-6 ratti in ogni gruppo. Il numero di celle viene visualizzato nella parte inferiore delle barre. Segno rosso (C, D) e le barre con linee verticali (E, F) indicano la media ± SEM. * *P< 0.01 vs non addestrato ratti. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura. Buffer di dissezione (totale 1L) NaH2PO4 • 2 H2O 0,195 g 1,25 mmol/L KCl g 0,188 2,5 mmol/L CaCl2 0,074 g 0,5 mmol/L MgCl2 • 6 H2O 1,423 g 7.0 mmol/L Cloruro di colina 12,579 g 90 mmol/L Acido ascorbico 2,340 g 11,6 mmol/L Acido piruvico 0,342 g 3,1 mmol/L NaHCO3 2,100 g 25 mmol/L Glucosio 4,500 g 25 mmol/L Tabella 1: Una ricetta per il buffer di dissezione CSF artificiale (totale 1L) KCl 0,186 g 2,5 mmol/L NaCl 6,700 g 114,6 mmol/L NaH2PO4 •2H2O 0,156 g 1 mmol/L Glucosio 1,800 g 10 mmol/L NaHCO3 2,184 g 26 mmol/L 1M MgCl2 4 mL 4 mmol/L 1M CaCl2 4 mL 4 mmol/L Tabella 2: Una ricetta per artificiale del liquido cerebrospinale (CSF) Soluzione intracellulare per pinza amperometrica (Totale 200 mL) KCl 0,0746 g 5 mmol/L K-gluconato 6,089 g 130 mmol/L HEPES 0,476 g 10 mmol/L EGTA 0,0456 g 0,6 mmol/L 1M MgCl2 500 Μ l 2,5 mmol/L Na2 ATP 0,4408 g 4 mmol/L Na3 GTP 0,0418 g 0,4 mmol/L Fosfocreatina na 0,510 g 10 mmol/L Tabella 3: Registrazione di una ricetta per una soluzione intracellulare per pinza amperometrica Soluzione intracellulare per morsetto di tensione (Totale 200 mL) CsMeSO3 5.244 g (5.814) * 115 mmol/L (127,5) * CsCl 0,672 g (0,252) * 20 mmol/L (7,5) * HEPES 0,476 g 10 mmol/L EGTA 0,0456 g 0,6 mmol/L 1M MgCl2 500 Μ l 2,5 mmol/L Na2 ATP 0,4408 g 4 mmol/L Na3 GTP 0,0418 g 0,4 mmol/L Fosfocreatina na 0,510 g 10 mmol/L * bassa concentrazione di Cl– per le registrazioni in miniatura Tabella 4: Registrazione di una ricetta per una soluzione intracellulare per morsetto di tensione Parametri non addestrato IA addestrato spaiato camminare attraverso ampiezza mEPSC Varianza 5.8 32,1 4.7 5.9 Deviazione standard 2.4 5.7 2.2 2.4 Coefficiente di variazione 0,189 0.326 0.177 0.190 ampiezza mIPSC Varianza 17,1 56,7 31,8 20,7 Deviazione standard 4.1 7.5 5.6 4.5 Coefficiente di variazione 0.279 0,387 0,367 0.286 Tabella 5: La diversità della miniatura inibitori ed eccitatori postsinaptici corrente (mEPSC e mIPSC) ampiezze in inibitorio dell’evitare (IA)-addestrato ratti Parametri non addestrato IA addestrato spaiato camminare attraverso mEPSC frequenza Varianza 278 2195 188 195 Deviazione standard 17 47 14 14 Coefficiente di variazione 0.902 1.198 0.893 0,874 mIPSC frequenza Varianza 3282 27212 1385 5135 Deviazione standard 57 165 37 72 Coefficiente di variazione 1.195 1.006 0,955 0.836 Tabella 6: La diversità della miniatura inibitori ed eccitatori postsinaptici corrente (mEPSC e mIPSC) frequenze in inibitorio dell’evitare (IA)-addestrato ratti