Wirbelsäule Neuronen Isolierung und Kultur aus neonatalen Mäusen

Das Verständnis der Rückenmarkpathologie erfordert die Verwendung verschiedener Modelle, sowohl auf makroskopischer als auch auf mikroskopischer Ebene. Große und kleine Tiermodelle ^{1 , 2 , 3} werden für in vivo Untersuchungen von Rückenmarkserkrankungen und Verletzungen verwendet. Während das Studium dieser Probleme in vivo hat seine Verdienste, ist die Analyse des Rückenmarks auf ganze Rückenmark-Homogenat oder Gewebe-Abschnitte ^{4 begrenzt} . Dies schafft eine gewisse Unklarheit beim Versuch, spezifische Reaktionen und Ziele im Rückenmark unter seinen residenten Neuronen und umgebenden Glia zu isolieren. Die zunehmende Verfügbarkeit von genetisch manipulierten Mäusen ermöglicht detailliertere Untersuchungen der Biologie auf zellulärer und molekularer Ebene. So wird hier ein neonatales Mausmodell verwendet, das die Untersuchung der einzigartigen Eigenschaften und der Biologie der Rückenmark-Neuronen in vitro ermöglicht .

Die Isolierung und Aufrechterhaltung von Neuronen in vitro ist nicht besonders einfach. Es gibt eine relative Häufigkeit von Techniken für die Neuronisolation aus dem kortikalen Gewebe von adulten Nagetieren, die in einer beträchtlichen Anzahl von isolierten Neuronen ( dh Millionen) ^{5 , 6 , 7.} Im Gegensatz dazu ist die Ausbeute an Neuronen aus dem Rückenmarkgewebe geringer, ^{8 , 9 , 10} , zum Teil aufgrund der geringeren Gewebemasse. Darüber hinaus gibt es bei Mäusen eine relative Mangel an Techniken zur Isolierung von Neugeborenen Rückenmarksneuronen und bestehende Methoden sind durch niedrigere Neuronenausbeuten ( dh Hunderte) ⁹ oder mühsame und ressourcenschonende Techniken begrenzt, die die Isolierung von embryonalen Mäusen erfordern ¹⁰ .

In diesem Protokoll, wirVerwenden Sie eine Technik, die die kosten- und ressourcenwirksame Isolierung einer beträchtlichen Anzahl von Neuronen aus den Rückenmarken von Neugeborenen ermöglicht. Wie es bei bisher veröffentlichten Techniken üblich ist, verwenden wir Papain als enzymatische Protease und erlauben die Freisetzung von Neuronen aus dem Rückenmarksgewebe ^{5 , 6} . Darüber hinaus verwenden wir einen Dichtegradienten für die raffinierte Zelltrennung, der sich bisher als wirksam erwiesen hat ^{6 , 10} . Während das Medium, in dem die Zellen inkubiert werden, in unserer Erfahrung variieren kann und wie bereits veröffentlicht ¹¹ , ergänzt sich die Ergänzung mit frischem B27-Kulturmedium-Supplement als kritisch für die Neuron-Langlebigkeit. Die Neuronen sind typischerweise für bis zu 10 Tage lebensfähig, so dass eine Behandlung durchgeführt werden kann.