Aislamiento y Cultura de Neuronas de la Médula Espinal de Ratones Neonatales
Summary
Este estudio presenta una técnica para el aislamiento de neuronas de ratones neonatales WT. Requiere la cuidadosa disección de la médula espinal del ratón neonatal, seguida de la separación de las neuronas del tejido de la médula espinal mediante escisión mecánica y enzimática.
Abstract
Presentamos un protocolo para el aislamiento y cultivo de neuronas de la médula espinal. Las neuronas se obtienen a partir de ratones C57BL / 6 neonatales y se aíslan el día 1-3 postnatal. Una litera de ratón, generalmente 4-10 cachorros nacidos de un par reproductor, se recolecta para un experimento, y las médulas espinales se recogen individualmente de cada ratón después de la eutanasia con isoflurano. La columna vertebral se disecciona y luego la médula espinal se libera de la columna. Las médulas espinales se cortan entonces para aumentar el área superficial de suministro para una proteasa enzimática que permite que las neuronas y otras células sean liberadas del tejido. La trituración se utiliza entonces para liberar las células en solución. Esta solución se fracciona posteriormente en un gradiente de densidad para separar las diversas células en solución, permitiendo que las neuronas sean aisladas. Aproximadamente 1-2.5 x 10 6 neuronas se pueden aislar de un grupo de la litera. Las neuronas se sembraron luego en pocillos recubiertos con adhesivoRs que permiten un crecimiento y maduración adecuados. Las neuronas tardan aproximadamente 7 días en alcanzar la madurez en el medio de crecimiento y cultivo y pueden utilizarse posteriormente para tratamiento y análisis.
Introduction
La comprensión de la patología de la médula espinal requiere el uso de varios modelos, tanto en los niveles macroscópico y microscópico. Los modelos animales grandes y pequeños 1 , 2 , 3 se usan para investigaciones in vivo de la enfermedad y lesión de la médula espinal. Mientras que el estudio de estos temas in vivo tiene sus méritos, el análisis de la médula espinal se limita a toda la médula espinal homogenado o tejido secciones [ 4] . Esto crea cierta ambigüedad al tratar de aislar respuestas específicas y objetivos en la médula espinal entre sus neuronas residentes y la glía circundante. La creciente disponibilidad de ratones manipulados genéticamente permite realizar investigaciones más detalladas de la biología a nivel celular y molecular. Por lo tanto, un modelo de ratón neonatal se utiliza aquí, lo que permite el estudio de las propiedades únicas y la biología de las neuronas de la médula espinal in vitro .
El aislamiento y el mantenimiento de las neuronas in vitro no es particularmente sencillo.Existe una abundancia relativa de técnicas para el aislamiento neuronal del tejido cortical de los roedores adultos que parecen resultar en un número sustancial de neuronas aisladas ( es decir, millones) 5 , 6 , 7. En cambio, el rendimiento de las neuronas del tejido de la médula espinal es inferior 8 , 9 , 10 , en parte debido a la menor masa de tejido, y en los ratones existe una relativa escasez de técnicas para el aislamiento de neonatos Las neuronas de la médula espinal y los métodos existentes están limitados por rendimientos de neuronas más bajos ( es decir, cientos) 9 o por técnicas laboriosas y pesadas en recursos que requieren el aislamiento de ratones embrionarios 10 .En este protocolo,Utilice una técnica que permita el aislamiento económico y eficaz de un número sustancial de neuronas de las médulas espinales de los ratones neonatales. Como es común en las técnicas publicadas anteriormente, utilizamos la papaína como una proteasa enzimática, lo que permite la liberación de neuronas del tejido de la médula espinal 5 , 6 . Además, se utiliza un gradiente de densidad para la separación refinada de células, que se ha demostrado que es eficaz 6 , 10 . Mientras que el medio en el que las células se incuban puede variar, en nuestra experiencia y como se publicó anteriormente 11 , la suplementación con el suplemento de medio de cultivo B27 fresco ha demostrado ser crítico para la longevidad de las neuronas. Las neuronas son típicamente viables hasta 10 días, permitiendo que se realice el tratamiento.
Protocol
Representative Results
Discussion
Esta técnica permite el cultivo confiable de las neuronas de la médula espinal. Una vez que la habilidad en la técnica se logra, se tarda aproximadamente 3,5 horas en completarse. Hemos podido llevar a cabo el aislamiento de neuronas de 2 camadas separadas (16 ratones en total) en aproximadamente 4 h. El paso clave en la factibilidad es ser capaces de extraer de manera competente las médulas espinales de los ratones. El rendimiento permite el chapado de varios pozos y la capacidad de probar las neuronas en diversas …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Los autores no tienen reconocimientos.
Materials
| Hibernate A Medium – 500 mL | Thermo-Fisher | A1247501 | https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/A1247501 |
| Hibernate A Minus Calcium – 500 mL | Brainbits | HA-Ca | http://www.brainbitsllc.com/hibernate-a-minus-calcium/ |
| Glutamax 100X – 100 mL | Thermo-Fisher | 35050061 | https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/35050079 |
| B27 Supplement 50X – 10 mL | Thermo-Fisher | 17504044 | https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/17504044 |
| Papain, Lyophilized – 100 mg | Worthington | LS003119 | http://www.worthington-biochem.com/pap/cat.html |
| Neurobasal A Medium – 500 mL | Thermo-Fisher | 10888022 | https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/10888022 |
| Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) | Thermo-Fisher | 15140122 | https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/15140122 |
| Poly-D-lysine hydrobromide – 5 mg | Sigma-Aldrich | P6407-5MG | http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/p6407?lang=en®ion=US |
| Mouse Laminin – 1 mg | Thermo-Fisher | 23017015 | https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/23017015 |
| Trypan Blue – 20 mL | Sigma-Aldrich | T8154-20ML | http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/t8154?lang=en®ion=US |
| OptiPrep Density Gradient Medium – 250 mL | Sigma-Aldrich | D1556-250ML | http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/d1556?lang=en®ion=US |
| Dichlorodimethylsilane (DMDCS, Sigma Silicoat) | Sigma-Aldrich | 440272-100ML | http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/aldrich/440272?lang=en®ion=US |
| Chloroform | Sigma-Aldrich | 288306-1L | http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sial/288306?lang=en®ion=US |
| Glass Pippette – 9" | Sigma-Aldrich | 13-678-20C | http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/cls7095d9?lang=en®ion=US |
| Pipette bulb – 5 mL | Sigma-Aldrich | Z186678-3EA | http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/aldrich/z186678?lang=en®ion=US&cm_sp=Insite-_-prodRecCold_xviews-_-prodRecCold10-1 |
| BRAND® Petri dish, glass – 60×15 mm | Sigma-Aldrich | BR455717-10EA | http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/aldrich/br455717?lang=en®ion=US |
| Sterile 24 Well Cell Culture Plate | Sigma-Aldrich | M8812-100EA | http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/m8812?lang=en®ion=US |
| Hausser Hemacytometer (glass counting chamber) | Fischer Scientific | 02-671-6 | https://www.fishersci.com/shop/products/hausser-bright-line-phase-hemacytometer-hemacytometer/026716 |
| Glass Slides – 12 mm sterile cover glass – uncoated | Neuvitro | GG-12-1.5-Pre | http://www.neuvitro.com/german-coverslip-12mm-diameter.htm |
| NeuN Rabbit Monoclonal Antibody – 100 µL | Abcam | ab177487 | After fixing in paraformaldehyde and blocking with 5% BSA, cells on a 12 mm coverslip were incubated in the antibody diluded to 1:200 for 18 hours in 4 °C |
| MAP-2 Mouse Monoclonal Antibody – 50 µL | Abcam | ab11267 | After fixing in paraformaldehyde and blocking with 5% BSA, cells on a 12 mm coverslip were incubated in the antibody diluded to 1:500 for 18 hours in 4 °C |
References
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