Изоляция и культура нейронов спинного мозга от неонатальных мышей
Summary
В этом исследовании представлен метод выделения нейронов у неонатальных мышей WT. Это требует тщательной диссекции спинного мозга от неонатальной мыши с последующим отделением нейронов от ткани спинного мозга путем механического и ферментативного расщепления.
Abstract
Мы представляем протокол для изоляции и культуры нейронов спинного мозга. Нейроны получают от неонатальных мышей C57BL / 6 и выделяют в послеродовой день 1-3. В одном эксперименте собирают мышь, обычно 4-10 щенков, рожденных из одной размножающейся пары, и спинальные шнуры собираются индивидуально от каждой мыши после эвтаназии с изофлураном. Позвоночник расщепляется, а затем спинной мозг высвобождается из колонки. Затем спинальные шнуры измельчают для увеличения площади поверхности доставки для ферментативной протеазы, которая позволяет высвобождать нейроны и другие клетки из ткани. Затем растирание происходит в растворе. Этот раствор затем фракционируют в градиенте плотности для отделения различных клеток в растворе, позволяя выделить нейроны. Приблизительно 1-2,5 × 10 6 нейронов можно выделить из одной группы подстилок. Затем нейроны высевают на лунки, покрытые клеем factoКоторые обеспечивают правильный рост и созревание. Нейроны занимают приблизительно 7 дней для достижения зрелости в среде роста и культивирования и могут быть использованы после этого для лечения и анализа.
Introduction
Понимание патологии спинного мозга требует использования различных моделей, как на макроскопическом, так и на микроскопическом уровнях. Крупные и мелкие животные модели 1 , 2 , 3 используются для исследований in vivo заболеваний и травм спинного мозга. При изучении этих проблем in vivo имеет свои достоинства, анализ спинного мозга ограничен гомогенатом всего спинного мозга или секциями тканей 4 . Это создает некоторую двусмысленность при попытке изолировать конкретные ответы и цели в спинном мозге среди его резидентных нейронов и окружающих глии. Увеличение доступности генетически управляемых мышей позволяет более детально исследовать биологию на клеточном и молекулярном уровнях. Таким образом, здесь используется неонатальная модель мыши, позволяющая изучать уникальные свойства и биологию нейронов спинного мозга in vitro .
Изоляция и поддержание нейронов in vitro не особенно прямолинейны. Существует относительное изобилие методов изоляции нейронов от кортикальной ткани взрослых грызунов, которые, как представляется, приводят к значительному количеству изолированных нейронов ( т. Е. Миллионов) 5 , 6 , 7. Напротив, выход нейронов из ткани спинного мозга ниже 8 , 9 , 10 , частично из-за меньшей массы ткани. Кроме того, у мышей наблюдается относительная малочисленность методов изоляции неонатальных Нейроны спинного мозга и существующие методы ограничены более низкими выходами нейронов ( т. Е. Сотнями) 9 или трудоемкими и ресурсоемкими методами, требующими выделения эмбриональных мышей 10 .В этом протоколе мыИспользуйте методику, позволяющую экономически выгодную изоляцию значительного числа нейронов из спинальных клеток неонатальных мышей. Как обычно в ранее опубликованных методах, мы используем папаин в качестве ферментативной протеазы, позволяя высвобождать нейроны из ткани спинного мозга 5 , 6 . Кроме того, мы используем градиент плотности для рафинированного разделения клеток, который ранее считался эффективным 6 , 10 . В то время как среда, в которой клетки инкубируются, может различаться, по нашему опыту и, как было опубликовано ранее 11 , добавка с добавлением новой питательной среды B27 оказалась критической для долголетия нейронов. Нейроны обычно жизнеспособны на срок до 10 дней, что позволяет проводить лечение.
Protocol
Representative Results
Discussion
Этот метод позволяет обеспечить надежную культуру нейронов спинного мозга. Как только уровень владения техникой будет достигнут, для завершения потребуется приблизительно 3,5 часа. Мы смогли провести изоляцию нейронов от 2 отдельных пометов (всего 16 мышей) примерно через 4 часа. Ключевы…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
У авторов нет подтверждений.
Materials
| Hibernate A Medium – 500 mL | Thermo-Fisher | A1247501 | https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/A1247501 |
| Hibernate A Minus Calcium – 500 mL | Brainbits | HA-Ca | http://www.brainbitsllc.com/hibernate-a-minus-calcium/ |
| Glutamax 100X – 100 mL | Thermo-Fisher | 35050061 | https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/35050079 |
| B27 Supplement 50X – 10 mL | Thermo-Fisher | 17504044 | https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/17504044 |
| Papain, Lyophilized – 100 mg | Worthington | LS003119 | http://www.worthington-biochem.com/pap/cat.html |
| Neurobasal A Medium – 500 mL | Thermo-Fisher | 10888022 | https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/10888022 |
| Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) | Thermo-Fisher | 15140122 | https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/15140122 |
| Poly-D-lysine hydrobromide – 5 mg | Sigma-Aldrich | P6407-5MG | http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/p6407?lang=en®ion=US |
| Mouse Laminin – 1 mg | Thermo-Fisher | 23017015 | https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/23017015 |
| Trypan Blue – 20 mL | Sigma-Aldrich | T8154-20ML | http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/t8154?lang=en®ion=US |
| OptiPrep Density Gradient Medium – 250 mL | Sigma-Aldrich | D1556-250ML | http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/d1556?lang=en®ion=US |
| Dichlorodimethylsilane (DMDCS, Sigma Silicoat) | Sigma-Aldrich | 440272-100ML | http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/aldrich/440272?lang=en®ion=US |
| Chloroform | Sigma-Aldrich | 288306-1L | http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sial/288306?lang=en®ion=US |
| Glass Pippette – 9" | Sigma-Aldrich | 13-678-20C | http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/cls7095d9?lang=en®ion=US |
| Pipette bulb – 5 mL | Sigma-Aldrich | Z186678-3EA | http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/aldrich/z186678?lang=en®ion=US&cm_sp=Insite-_-prodRecCold_xviews-_-prodRecCold10-1 |
| BRAND® Petri dish, glass – 60×15 mm | Sigma-Aldrich | BR455717-10EA | http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/aldrich/br455717?lang=en®ion=US |
| Sterile 24 Well Cell Culture Plate | Sigma-Aldrich | M8812-100EA | http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/m8812?lang=en®ion=US |
| Hausser Hemacytometer (glass counting chamber) | Fischer Scientific | 02-671-6 | https://www.fishersci.com/shop/products/hausser-bright-line-phase-hemacytometer-hemacytometer/026716 |
| Glass Slides – 12 mm sterile cover glass – uncoated | Neuvitro | GG-12-1.5-Pre | http://www.neuvitro.com/german-coverslip-12mm-diameter.htm |
| NeuN Rabbit Monoclonal Antibody – 100 µL | Abcam | ab177487 | After fixing in paraformaldehyde and blocking with 5% BSA, cells on a 12 mm coverslip were incubated in the antibody diluded to 1:200 for 18 hours in 4 °C |
| MAP-2 Mouse Monoclonal Antibody – 50 µL | Abcam | ab11267 | After fixing in paraformaldehyde and blocking with 5% BSA, cells on a 12 mm coverslip were incubated in the antibody diluded to 1:500 for 18 hours in 4 °C |
References
- Qayumi, A. K., et al. Animal model for investigation of spinal cord injury caused by aortic cross-clamping. J Invest Surg. 10 (1-2), 47-52 (1997).
- Fang, B., et al. Ischemic preconditioning protects against spinal cord ischemia-reperfusion injury in rabbits by attenuating blood spinal cord barrier disruption. Int J Mol Sci. 14 (5), 10343-10354 (2013).
- Taira, Y., Marsala, M. Effect of proximal arterial perfusion pressure on function, spinal cord blood flow, and histopathologic changes after increasing intervals of aortic occlusion in the rat. Stroke. 27 (10), 1850-1858 (1996).
- Stoppini, L., Buchs, P. -. A., Muller, D. A simple method for organotypic cultures of nervous tissue. J Neurosci Methods. 37 (2), 173-182 (1991).
- Ahlemeyer, B., Baumgart-Vogt, E. Optimized protocols for the simultaneous preparation of primary neuronal cultures of the neocortex, hippocampus and cerebellum from individual newborn (P0. 5) C57Bl/6J mice. J Neurosci Methods. 149 (2), 110-120 (2005).
- Brewer, G. J., Torricelli, J. R. Isolation and culture of adult neurons and neurospheres. Nat Protoc. 2 (6), 1490-1498 (2007).
- Banker, G. A., Cowan, W. M. Rat hippocampal neurons in dispersed cell culture. Brain Res. 126 (3), 397-425 (1977).
- Graber, D. J., Harris, B. T. Purification and culture of spinal motor neurons from rat embryos. Cold Spring Harb Protoc. 2013 (4), 319-326 (2013).
- Anderson, K. N., Potter, A. C., Piccenna, L. G., Quah, A. K., Davies, K. E., Cheema, S. S. Isolation and culture of motor neurons from the newborn mouse spinal cord. Brain Res Prot. 12 (3), 132-136 (2004).
- Gingras, M., Gagnon, V., Minotti, S., Durham, H. D., Berthod, F. Optimized protocols for isolation of primary motor neurons, astrocytes and microglia from embryonic mouse spinal cord. J Neurosci Methods. 163 (1), 111-118 (2007).
- Brewer, G. J., et al. Optimized survival of hippocampal neurons in B27-supplemented Neurobasal, a new serum-free medium combination. J Neurosci Res. 35 (5), 567-576 (1993).
- Fang, B., et al. Ischemic preconditioning protects against spinal cord ischemia-reperfusion injury in rabbits by attenuating blood spinal cord barrier disruption. Int J Mol Sci. 14 (5), 10343-10354 (2013).
- Su, M., Zhong, W., Ren, S. Dose-dependent protection of reseveratrol against spinal cord ischemic-reperfusion injury in rats. Trop J Pharm Res. 15 (6), 1225-1233 (2016).
- Haapanen, H., et al. Remote ischemic preconditioning protects the spinal cord against ischemic insult: An experimental study in a porcine model. J Thorac Cardiovasc Surg. 151 (3), 777-785 (2016).
- Conrad, M. F., Ye, J. Y., Chung, T. K., Davison, J. K., Cambria, R. P. Spinal cord complications after thoracic aortic surgery: long-term survival and functional status varies with deficit severity. J Vasc Surg. 48 (1), 47-53 (2008).
- Wong, D. R., et al. Delayed spinal cord deficits after thoracoabdominal aortic aneurysm repair. Ann Thorac Surg. 83 (4), 1345-1355 (2007).
- Freeman, K. A., et al. Alpha-2 agonist attenuates ischemic injury in spinal cord neurons. J Surg Res. 195 (1), 21-28 (2015).
- Freeman, K. A., et al. Spinal cord protection via alpha-2 agonist-mediated increase in glial cell-line-derived neurotrophic factor. J Thorac Cardiovasc Surg. 149 (2), 578-586 (2015).
