الحبل الشوكي العصبونات العزلة والثقافة من الفئران حديثي الولادة
Summary
تقدم هذه الدراسة تقنية لعزل الخلايا العصبية من الفئران حديثي الولادة وت. فإنه يتطلب تشريح دقيق من الحبل الشوكي من الماوس حديثي الولادة، تليها فصل الخلايا العصبية من أنسجة الحبل الشوكي من خلال الانقسام الميكانيكية والانزيمية.
Abstract
نقدم بروتوكول لعزل وثقافة الخلايا العصبية الحبل الشوكي. يتم الحصول على الخلايا العصبية من حديثي الولادة C57BL / 6 الفئران ويتم عزلها في يوم ما بعد الولادة 1-3. يتم جمع القمامة الماوس، وعادة 4-10 الجراء ولدت من زوج تربية واحد، لتجربة واحدة، ويتم جمع الحبال الشوكي بشكل فردي من كل الماوس بعد القتل الرحيم مع إيسوفلوران. يتم تشريح العمود الفقري بها ومن ثم يتم تحرير الحبل الشوكي من العمود. ثم يتم مفرغة الحبل الشوكي لزيادة مساحة سطح التسليم للبروتياز الأنزيمية التي تسمح للخلايا العصبية والخلايا الأخرى أن يطلق سراحه من الأنسجة. ثم يتم استخدام تريتوراتيون لإطلاق الخلايا في حل. هذا الحل في وقت لاحق مجزأة في التدرج الكثافة لفصل الخلايا المختلفة في حل، مما يسمح للعصبية لتكون معزولة. يمكن عزل ما يقرب من 1-2.5 × 10 6 الخلايا العصبية من مجموعة القمامة واحدة. ثم يتم تصنيف الخلايا العصبية على الآبار المغلفة مع فاكتو لاصقةرس التي تسمح للنمو السليم والنضج. وتستغرق الخلايا العصبية حوالي 7 أيام للوصول إلى مرحلة النضج في النمو والثقافة المتوسطة ويمكن استخدامها بعد ذلك للعلاج والتحليل.
Introduction
فهم أمراض الحبل الشوكي يتطلب استخدام نماذج مختلفة، سواء على المستويات المجهرية والميكروسكوبية. وتستخدم النماذج الحيوانية الكبيرة والصغيرة 1 ، 2 ، 3 في التحقيقات في الجسم الحي من مرض الحبل الشوكي والإصابات. في حين دراسة هذه القضايا في الجسم الحي له مزاياه، وتحليل الحبل الشوكي يقتصر على كامل جنون الحبل الشوكي أو أقسام الأنسجة 4 . هذا يخلق بعض الغموض عند محاولة عزل ردود محددة والأهداف في الحبل الشوكي بين الخلايا العصبية المقيمين والدبقية المحيطة بها. زيادة توافر الفئران التلاعب وراثيا يسمح لإجراء تحقيقات أكثر تفصيلا في علم الأحياء على المستويات الخلوية والجزيئية. وهكذا، يتم استخدام نموذج الماوس حديثي الولادة هنا، مما يسمح لدراسة خصائص فريدة من نوعها وعلم الأحياء من الخلايا العصبية الحبل الشوكي في المختبر .
إن "عزل الخلايا العصبية في المختبر وصيانتها ليس واضحا بشكل خاص، وهناك وفرة نسبية من تقنيات عزل العصبونات من الأنسجة القشرية للقوارض البالغة التي يبدو أنها تؤدي إلى عدد كبير من الخلايا العصبية المعزولة ( أي الملايين) 5 ، 6 ، 7. في المقابل، فإن العائد من الخلايا العصبية من أنسجة الحبل الشوكي هو أقل 8 ، 9 ، 10 ، ويرجع ذلك جزئيا إلى كتلة أصغر من الأنسجة.وعلاوة على ذلك، في الفئران، وهناك قلة نسبي من التقنيات لعزل حديثي الولادة والخلايا العصبية الحبل الشوكي، والأساليب القائمة محدودة من قبل انخفاض الخلايا العصبية ( أي المئات) 9 أو التقنيات الشاقة والموارد الثقيلة التي تتطلب عزل الفئران الجنينية 10 .في هذا البروتوكول، ونحناستخدام تقنية تسمح لعزل فعالة من حيث التكلفة والموارد من عدد كبير من الخلايا العصبية من الحبل الشوكي من الفئران حديثي الولادة. كما هو شائع في التقنيات المنشورة سابقا، ونحن نستخدم غشاء كما الأنزيمية الأنزيمية، مما يسمح للإفراج عن الخلايا العصبية من أنسجة الحبل الشوكي 5 ، 6 . وبالإضافة إلى ذلك، ونحن نستخدم التدرج الكثافة لفصل الخلية المكرر، والتي سبق أن ثبت أن تكون فعالة 6 ، 10 . في حين أن الوسيط الذي يتم فيه حضانة الخلايا يمكن أن تختلف، في تجربتنا وكما نشرت سابقا 11 ، مكملات مع الطازجة B27 تكملة متوسطة الثقافة وقد ثبت أن تكون حاسمة لطول العمر العصبية. الخلايا العصبية هي عادة قابلة للحياة لمدة تصل إلى 10 يوما، مما يسمح للعلاج أن تنفذ.
Protocol
Representative Results
Discussion
هذه التقنية تسمح للثقافة موثوق بها من الخلايا العصبية الحبل الشوكي. بمجرد تحقيق الكفاءة في هذه التقنية، يستغرق حوالي 3.5 ساعة لإكمال. كنا قادرين على تنفيذ العزلة من الخلايا العصبية من 2 ليترز منفصلة (16 الفئران المجموع) في حوالي 4 ساعات. الخطوة الرئيسية في الجدوى هو أن تك…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
المؤلفين ليس لديهم اعترافات.
Materials
| Hibernate A Medium – 500 mL | Thermo-Fisher | A1247501 | https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/A1247501 |
| Hibernate A Minus Calcium – 500 mL | Brainbits | HA-Ca | http://www.brainbitsllc.com/hibernate-a-minus-calcium/ |
| Glutamax 100X – 100 mL | Thermo-Fisher | 35050061 | https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/35050079 |
| B27 Supplement 50X – 10 mL | Thermo-Fisher | 17504044 | https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/17504044 |
| Papain, Lyophilized – 100 mg | Worthington | LS003119 | http://www.worthington-biochem.com/pap/cat.html |
| Neurobasal A Medium – 500 mL | Thermo-Fisher | 10888022 | https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/10888022 |
| Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) | Thermo-Fisher | 15140122 | https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/15140122 |
| Poly-D-lysine hydrobromide – 5 mg | Sigma-Aldrich | P6407-5MG | http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/p6407?lang=en®ion=US |
| Mouse Laminin – 1 mg | Thermo-Fisher | 23017015 | https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/23017015 |
| Trypan Blue – 20 mL | Sigma-Aldrich | T8154-20ML | http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/t8154?lang=en®ion=US |
| OptiPrep Density Gradient Medium – 250 mL | Sigma-Aldrich | D1556-250ML | http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/d1556?lang=en®ion=US |
| Dichlorodimethylsilane (DMDCS, Sigma Silicoat) | Sigma-Aldrich | 440272-100ML | http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/aldrich/440272?lang=en®ion=US |
| Chloroform | Sigma-Aldrich | 288306-1L | http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sial/288306?lang=en®ion=US |
| Glass Pippette – 9" | Sigma-Aldrich | 13-678-20C | http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/cls7095d9?lang=en®ion=US |
| Pipette bulb – 5 mL | Sigma-Aldrich | Z186678-3EA | http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/aldrich/z186678?lang=en®ion=US&cm_sp=Insite-_-prodRecCold_xviews-_-prodRecCold10-1 |
| BRAND® Petri dish, glass – 60×15 mm | Sigma-Aldrich | BR455717-10EA | http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/aldrich/br455717?lang=en®ion=US |
| Sterile 24 Well Cell Culture Plate | Sigma-Aldrich | M8812-100EA | http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/m8812?lang=en®ion=US |
| Hausser Hemacytometer (glass counting chamber) | Fischer Scientific | 02-671-6 | https://www.fishersci.com/shop/products/hausser-bright-line-phase-hemacytometer-hemacytometer/026716 |
| Glass Slides – 12 mm sterile cover glass – uncoated | Neuvitro | GG-12-1.5-Pre | http://www.neuvitro.com/german-coverslip-12mm-diameter.htm |
| NeuN Rabbit Monoclonal Antibody – 100 µL | Abcam | ab177487 | After fixing in paraformaldehyde and blocking with 5% BSA, cells on a 12 mm coverslip were incubated in the antibody diluded to 1:200 for 18 hours in 4 °C |
| MAP-2 Mouse Monoclonal Antibody – 50 µL | Abcam | ab11267 | After fixing in paraformaldehyde and blocking with 5% BSA, cells on a 12 mm coverslip were incubated in the antibody diluded to 1:500 for 18 hours in 4 °C |
References
- Qayumi, A. K., et al. Animal model for investigation of spinal cord injury caused by aortic cross-clamping. J Invest Surg. 10 (1-2), 47-52 (1997).
- Fang, B., et al. Ischemic preconditioning protects against spinal cord ischemia-reperfusion injury in rabbits by attenuating blood spinal cord barrier disruption. Int J Mol Sci. 14 (5), 10343-10354 (2013).
- Taira, Y., Marsala, M. Effect of proximal arterial perfusion pressure on function, spinal cord blood flow, and histopathologic changes after increasing intervals of aortic occlusion in the rat. Stroke. 27 (10), 1850-1858 (1996).
- Stoppini, L., Buchs, P. -. A., Muller, D. A simple method for organotypic cultures of nervous tissue. J Neurosci Methods. 37 (2), 173-182 (1991).
- Ahlemeyer, B., Baumgart-Vogt, E. Optimized protocols for the simultaneous preparation of primary neuronal cultures of the neocortex, hippocampus and cerebellum from individual newborn (P0. 5) C57Bl/6J mice. J Neurosci Methods. 149 (2), 110-120 (2005).
- Brewer, G. J., Torricelli, J. R. Isolation and culture of adult neurons and neurospheres. Nat Protoc. 2 (6), 1490-1498 (2007).
- Banker, G. A., Cowan, W. M. Rat hippocampal neurons in dispersed cell culture. Brain Res. 126 (3), 397-425 (1977).
- Graber, D. J., Harris, B. T. Purification and culture of spinal motor neurons from rat embryos. Cold Spring Harb Protoc. 2013 (4), 319-326 (2013).
- Anderson, K. N., Potter, A. C., Piccenna, L. G., Quah, A. K., Davies, K. E., Cheema, S. S. Isolation and culture of motor neurons from the newborn mouse spinal cord. Brain Res Prot. 12 (3), 132-136 (2004).
- Gingras, M., Gagnon, V., Minotti, S., Durham, H. D., Berthod, F. Optimized protocols for isolation of primary motor neurons, astrocytes and microglia from embryonic mouse spinal cord. J Neurosci Methods. 163 (1), 111-118 (2007).
- Brewer, G. J., et al. Optimized survival of hippocampal neurons in B27-supplemented Neurobasal, a new serum-free medium combination. J Neurosci Res. 35 (5), 567-576 (1993).
- Fang, B., et al. Ischemic preconditioning protects against spinal cord ischemia-reperfusion injury in rabbits by attenuating blood spinal cord barrier disruption. Int J Mol Sci. 14 (5), 10343-10354 (2013).
- Su, M., Zhong, W., Ren, S. Dose-dependent protection of reseveratrol against spinal cord ischemic-reperfusion injury in rats. Trop J Pharm Res. 15 (6), 1225-1233 (2016).
- Haapanen, H., et al. Remote ischemic preconditioning protects the spinal cord against ischemic insult: An experimental study in a porcine model. J Thorac Cardiovasc Surg. 151 (3), 777-785 (2016).
- Conrad, M. F., Ye, J. Y., Chung, T. K., Davison, J. K., Cambria, R. P. Spinal cord complications after thoracic aortic surgery: long-term survival and functional status varies with deficit severity. J Vasc Surg. 48 (1), 47-53 (2008).
- Wong, D. R., et al. Delayed spinal cord deficits after thoracoabdominal aortic aneurysm repair. Ann Thorac Surg. 83 (4), 1345-1355 (2007).
- Freeman, K. A., et al. Alpha-2 agonist attenuates ischemic injury in spinal cord neurons. J Surg Res. 195 (1), 21-28 (2015).
- Freeman, K. A., et al. Spinal cord protection via alpha-2 agonist-mediated increase in glial cell-line-derived neurotrophic factor. J Thorac Cardiovasc Surg. 149 (2), 578-586 (2015).
