موقع التكامل ثنائي الاتجاه للفيروسات القهقرية منهجية ير والتحليل الكمي للبيانات سير العمل
Summary
تصف هذه المخطوطة الإجراء التجريبي وتحليل البرمجيات لمقايسة موقع التكامل ثنائية الاتجاه التي يمكن أن تحلل في وقت واحد المنبع والمصب ناقلات الحمض النووي تقاطع المضيف. يمكن استخدام منتجات ير ثنائية الاتجاه لأي منصة تسلسل المصب. البيانات الناتجة هي مفيدة لمقارنة عالية الإنتاجية، الكمية من أهداف الحمض النووي متكاملة.
Abstract
تعد مقايسات التكامل (إس) عنصرا حاسما في دراسة مواقع تكامل الفيروسة الرجعية وأهميتها البيولوجية. في دراسات العلاج الجيني للفيروسات الرجعية الأخيرة، استخدمت مقايسات إس، بالاقتران مع تسلسل الجيل التالي، كأداة تتبع الخلايا لتوصيف سكان الخلايا الجذعية النسيلي الذين يتقاسمون نفس الشيء. لمقارنة دقيقة من استنساخ الخلايا الجذعية ريبوبولاتينغ داخل وعبر عينات مختلفة، حساسية الكشف، استنساخ البيانات، والقدرة الإنتاجية العالية للمقايسة هي من بين الصفات فحص الأكثر أهمية. ويوفر هذا العمل بروتوكولا مفصلا وسير عمل تحليل البيانات لتحليل إس ثنائي الاتجاه. المقايسة ثنائية الاتجاه يمكن أن تتسلسل في وقت واحد كل من المنبع والمصب تقاطعات ناقلات المضيف. وبالمقارنة مع النهج التقليدية لتسلسل إس أحادي الاتجاه، فإن النهج ثنائي الاتجاه يحسن إلى حد كبير معدلات الكشف عن داعش وتوصيف أحداث التكامل عند طرفي tانه يستهدف الحمض النووي. ويحدد خط أنابيب تحليل البيانات الموصوفة هنا بدقة وتعدد متواليات إس المتطابقة من خلال خطوات متعددة من المقارنة ترسم متواليات إس على الجينوم المرجعي وتحدد أخطاء التسلسل. باستخدام إجراء الفحص الأمثل، قمنا مؤخرا بنشر أنماط إعادة إحياء مفصلة الآلاف من الخلايا الجذعية المكونة للدم (هسك) استنساخ التالية زرع في ماكاك ريسوس، مما يدل للمرة الأولى على نقطة زمنية دقيقة من إعادة التركيب هسك والتغاير الوظيفي ل هسس في نظام الرئيسيات. يصف البروتوكول التالي الإجراء التجريبي خطوة بخطوة وسير العمل تحليل البيانات التي تحدد بدقة وتحدد متواليات إس متطابقة.
Introduction
الفيروسات القهقرية تدخل الحمض النووي الجيني في الجينوم المضيف في مواقع مختلفة. هذه الخاصية الفريدة من نوعها، والتي قد تسهم في تطوير السرطانات وغيرها من أشكال المرضية الفيروسية، لديها فائدة سخرية من جعل هذه الفيروسات قابلة للتحويل إلى الهندسة الخلوية للعلاج الجيني والبحوث البيولوجيا الأساسية. موقع التكامل الفيروسي (إس) – الموقع على الجينوم المضيف حيث يتم دمج الحمض النووي (الفيروس) الأجنبية – له آثار هامة على مصير كل من الفيروسات المتكاملة والخلايا المضيفة. وقد استخدمت مقايسات إس في مختلف البيئات البحثية البيولوجية والسريرية لدراسة اختيار موقع الاندماج الفيروسي والامراض، وتطوير السرطان، وبيولوجيا الخلايا الجذعية، وعلم الأحياء التنموي 1 ، 2 ، 3 ، 4 . حساسية الكشف منخفضة، ضعف استنساخ البيانات، ومتكررة انتقال التلوث هي من بينالعوامل الرئيسية التي تحد من تطبيق مقايسات داعش على الدراسات الحالية والمخطط لها.
وقد تم تطوير العديد من تقنيات تحليل نظم المعلومات. مقايسات موقع الانزيم القائم على الانزيم، بما في ذلك تفاعلات البوليميراز المتسلسل (لم) 5 ، عكس ير 6 ، والخطي التضخيم بوساطة (لام) ير 7 ، هي الأكثر استخداما على نطاق واسع. ومع ذلك، فإن استخدام إنزيمات تقييد موقع معين يولد تحيزا خلال استرجاع داعش، مما يسمح فقط لمجموعة فرعية من إنتغرومز (الحمض النووي الأجنبي دمجها في الجينوم المضيف) في محيط موقع تقييد ليتم استردادها 4 . وقد أدخلت أيضا تقنيات الفحص التي تقيِّم أكثر شمولا ناقلات إس في السنوات الأخيرة. هذه المقايسات توظيف استراتيجيات مختلفة، بما في ذلك مو بوساطة ترانسبوسون ير 8 ، نونستريكتيف (نر) -LAM ير 9 ، نوع إي تقييد انزيم- مهضم 10 ، القص الميكانيكية 11 ، و ير القائم على هيكسامر ير (إعادة خالية ير) 12 ، لتجزئة الحمض النووي الجيني وتضخيم إس. التكنولوجيات الحالية لديها مستويات مختلفة من حساسية الكشف، وتغطية الجينوم، وخصوصية الهدف، والقدرة الإنتاجية العالية، وتعقيد إجراءات الفحص، والتحيز في الكشف عن الترددات النسبية للمواقع المستهدفة. ونظرا للصفات المتفاوتة للمقايسات الحالية ومجموعة متنوعة من الأغراض التي يمكن استخدامها، ينبغي اختيار نهج الفحص الأمثل بعناية.
ويوفر هذا العمل إجراءات تجريبية مفصلة وسير العمل تحليل البيانات الحاسوبية لمقايسة ثنائية الاتجاه التي تحسن إلى حد كبير معدلات الكشف وتسلسل دقة الكمي من خلال تحليل في وقت واحد من المنبع والمصب من الحمض النووي الهدف المتكامل (انظر الشكل 1 للحصول على وجهة نظر التخطيطي إجراءات الفحص ). ويوفر هذا النهج أيضا(على سبيل المثال، دقة ازدواجية الموقع المستهدف والاختلافات في التسلسلات الجينومية للإضافات في المنبع والمصب). وقد استخدمت طرق ثنائية الاتجاه الأخرى في المقام الأول لاستنساخ وتسلسل كلا طرفي الحمض النووي الهدف 11 ، 13 ، 14 . هذا الفحص هو الأمثل على نطاق واسع لانتاجية عالية والتقدير الكمي استنساخه من استنساخ ناقلات ملحوظ، وذلك باستخدام طريقة لم-ير راسخة ورسم الخرائط التحليل الحاسوبي، ولقياس كم تقاطعات المنبع والمصب. وقد أثبت التحليل ثنائي الاتجاه مع إنزيم تقعي مفيدة لكمية عالية الإنتاجية الكمي في الدراسات الجينية الخلايا الجذعية العلاج قبل السريرية 2 ، 15 . تصف هذه الورقة طريقة معدلة باستخدام القاطع الأكثر تواترا (رساي / كفيكي – موتيف: غاك) الذي يضاعف tانه فرص الكشف عن إنتغرومز مقارنة مقايسة تقيي . يتم وصف إجراءات التحليل التجريبي وتحليل البيانات التفصيلية التي تستخدم إنزيمات غتاك موتيف ل لنتيفيرال (NL4.3 ومشتقاته) و غاما-ريتروفيرال (بمكس ناقلات) ناقلات تحليل إس. وترد أوليغونوكلأوتيدس المستخدمة في الفحص في الجدول 1 . ويرد في البرنامج التكميلي نص برمجي داخلي لتحليل تسلسل نظم المعلومات.
Protocol
Representative Results
Discussion
المقايسة ثنائية الاتجاه تمكن التحليل المتزامن لكلا من تسلسل تقاطع الحمض النووي في اتجاه المنبع (يسار) والمصب (يمين) المضيف المضيف، ومفيد في عدد من العلاج الجيني، والخلايا الجذعية، وتطبيقات البحوث السرطان. استخدام الانزيمات موتيف غتاك (رساي و كفيكي) ونهج ير ثنائي الا?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
تم توفير التمويل من قبل المعاهد الوطنية للمنح الصحية R00-HL116234، U19 AI117941، و R56 HL126544؛ مؤسسة العلوم الوطنية منحة دمس-1516675؛ المؤسسة الوطنية للبحوث في كوريا (نرف-2011-0030049، نرف-2014M3C9A3064552)؛ وبرنامج مبادرة كريب.
Materials
| Thermostable DNA polymerase | Agilent | 600424 | PicoMaxx Polymerase |
| Thermostable DNA polymerase buffer | Agilent | 600424 | PicoMaxx Polymerase buffer |
| Deoxynucleotide (dNTP) solution mix | New England Biolabs | N0447L | dNTP solution mix (10mM each) |
| PCR tubes | VWR International | 53509-304 | PCR Strip Tubes With Individual Attached Caps |
| 2ml microcentrifuge tube | Molecular Bioproducts | 3453 | microcentrifuge tubes |
| PCR purification kit | Qiagen | 28106 | |
| RsaI | New England Biolabs | R0167L | restriction enzyme |
| CviQI | New England Biolabs | R0639L | restriction enzyme |
| Buffer A | New England Biolabs | B7204S | NEB CutSmart buffer |
| DNA Polymerase I large (klenow) fragment | New England Biolabs | M0210L | Blunting |
| streptavidin beads solution | Invitrogen | 60101 | Dynabeads kilobaseBINDER kit |
| Binding Solution | Invitrogen | 60101 | Dynabeads kilobaseBINDER kit |
| Washing Solution | Invitrogen | 60101 | Dynabeads kilobaseBINDER kit |
| magnetic stand | ThermoFisher | 12321D | DynaMag™-2 Magnet |
| T4 DNA ligase | New England Biolabs | M0202L | T4 DNA ligase |
| 10X T4 DNA ligase buffer | New England Biolabs | B0202S | T4 DNA ligase reaction buffer |
| 5X T4 DNA ligase buffer | Invitrogen | 46300-018 | T4 DNA ligase buffer with polyethylene glycol-8000 |
| UV-Vis spectrophotometer | Fisher Scientific | S06497 | Nanodrop 2000 |
| pvuII | new England Biolabs | R0151L | restriction enzyme |
| sfoI | new England Biolabs | R0606L | restriction enzyme |
| Buffer B | new England Biolabs | B7203S | NEB buffer 3.1 |
| Nuclease free water | Integrated DNA Technologies | 11-05-01-14 | |
| Capillary electrophoresis | Qiagen | 9001941 | QIAxcel capillary electrophoresis |
| Veriti 96-well Fast Thermal Cycler | Thermo Fisher Scientific | 4375305 | PCR Instrument |
| Rotating wheel (or Roller) | Eppendorf | M10534004 | Cell Culture Roller Drums |
| DNA size marker | Qiagen | 929559 | QX size marker (100-2,500 bp) |
| DNA size marker | Qiagen | 929554 | QX size marker (50-1,500 bp) |
| DNA alignment markers | Qiagen | 929524 | QX DNA Alignment Marker |
| genomc DNA | Not Available | Not Available | Sample genomc DNA from in vivo or in vitro experiments |
References
- Serrao, E., Engelman, A. N. Sites of Retroviral DNA Integration: From Basic Research to Clinical Applications. Crit. Rev. Biochem. Mol. Bio. 51 (1), 26-42 (2016).
- Kim, S., et al. Dynamics of HSPC Repopulation in Nonhuman Primates Revealed by a Decade-Long Clonal-Tracking Study. Cell Stem Cell. 14 (4), 473-485 (2014).
- Bushman, F. Retroviral integration and human gene therapy. J. Clin. Invest. 117 (8), 2083-2086 (2007).
- Bystrykh, L. V., Verovskaya, E., Zwart, E., Broekhuis, M., de Haan, G. Counting stem cells: methodological constraints. Nat Meth. 9 (6), 567-574 (2012).
- Schröder, A., et al. HIV-1 integration in the human genome favors active genes and local hotspots. Cell. 110 (4), 521-529 (2002).
- Silver, J., Keerikatte, V. Novel use of polymerase chain reaction to amplify cellular DNA adjacent to an integrated provirus. J. Virol. 64, 3150 (1990).
- Schmidt, M., et al. High-resolution insertion-site analysis by linear amplification-mediated PCR (LAM-PCR). Nat. Meth. 4 (12), 1051-1057 (2007).
- Brady, T., et al. A method to sequence and quantify DNA integration for monitoring outcome in gene therapy. Nucleic Acids Res. 39 (11), e72 (2011).
- Gabriel, R., et al. Comprehensive genomic access to vector integration in clinical gene therapy. Nat. Med. 15 (12), 1431-1436 (2009).
- Kim, S., Kim, Y., Liang, T., Sinsheimer, J., Chow, S. A high-throughput method for cloning and sequencing human immunodeficiency virus type 1 integration sites. J. Virol. 80 (22), 11313-11321 (2006).
- Maldarelli, F., et al. Specific HIV integration sites are linked to clonal expansion and persistence of infected cells. Science. 345 (6193), 179-183 (2014).
- Wu, C., et al. High Efficiency Restriction Enzyme-Free Linear Amplification-Mediated Polymerase Chain Reaction Approach for Tracking Lentiviral Integration Sites Does Not Abrogate Retrieval Bias. Hum. Gene. Ther. 24 (1), 38-47 (2013).
- Aker, M., Tubb, J., Miller, D. G., Stamatoyannopoulos, G., Emery, D. W. Integration Bias of Gammaretrovirus Vectors following Transduction and Growth of Primary Mouse Hematopoietic Progenitor Cells with and without Selection. Mol. Ther. 14 (2), 226-235 (2006).
- Gabriel, R., Kutschera, I., Bartholomae, C. C., von Kalle, C., Schmidt, M. Linear Amplification Mediated PCR; Localization of Genetic Elements and Characterization of Unknown Flanking DNA. J Vis Exp. (88), e51543 (2014).
- Kim, S., et al. High-throughput, sensitive quantification of repopulating hematopoietic stem cell clones. J. Virol. 84 (22), 11771-11780 (2010).
- Mitchell, R., et al. Retroviral DNA integration: ASLV, HIV, and MLV show distinct target site preferences. PLoS Biol. 2 (8), e234 (2004).
- Melkus, M., et al. Humanized mice mount specific adaptive and innate immune responses to EBV and TSST-1. Nat. Med. 12 (11), 1316-1322 (2006).
- Bystrykh, L. V. A combinatorial approach to the restriction of a mouse genome. BMC Res Notes. 6, 284 (2013).
- Beard, B. C., Adair, J. E., Trobridge, G. D., Kiem, H. -. P. High-throughput genomic mapping of vector integration sites in gene therapy studies. Methods Mol Biol. , 321-344 (2014).
- Gabriel, R., et al. Comprehensive genomic access to vector integration in clinical gene therapy. Nat. Med. 15 (12), 1431-1436 (2009).
- Qin, X., An, D., Chen, I., Baltimore, D. Inhibiting HIV-1 infection in human T cells by lentiviral-mediated delivery of small interfering RNA against CCR5. Proc Natl Acad Sci U S A. 100 (1), 183-188 (2003).
- Kitamura, T., et al. Retrovirus-mediated gene transfer and expression cloning: powerful tools in functional genomics. Exp. Hematol. 31 (11), 1007-1014 (2003).
- Cartier, N., et al. Hematopoietic stem cell gene therapy with a lentiviral vector in X-linked adrenoleukodystrophy. Science. 326 (5954), 818-823 (2009).
