双方向レトロウイルスの統合サイトPCRの方法論と定量的データ解析ワークフロー

レトロウイルスは、そのゲノムDNAを様々な部位の宿主ゲノムに挿入する。癌やその他のウイルス性病因の発生に寄与するこのユニークな特性は、これらのウイルスを遺伝子治療や基礎生物学研究のための細胞工学に非常に適したものにするという皮肉な利点があります。外来DNA（ウイルス）が組み込まれている宿主ゲノム上の場所であるウイルス統合サイト（IS）は、統合ウイルスと宿主細胞の両方の運命に重要な意味を持っています。 ISアッセイは、レトロウイルスの組込み部位の選択と病因、癌の発生、幹細胞の生物学、および発達生物学^1,2,3,4を研究するために、様々な生物学的および臨床的研究環境で使用されてきた。低い検出感度、低いデータ再現性、頻繁な相互汚染は現在のおよび計画された研究へのISアッセイの適用を制限する重要な要因である。

多くのIS分析技術が開発されている。リンカー媒介（LM）ポリメラーゼ連鎖反応（PCR） ⁵ 、逆PCR6、および線状増幅媒介（LAM）PCR7を含む制限酵素に基づく組込み部位アッセイが最も広く使用されている。しかしながら、部位特異的制限酵素の使用は、ISの回収中にバイアスを生成し、回収される制限部位の近傍の組込み体（宿主ゲノムに組み込まれた外来DNA）のサブセットのみを可能にする⁴ 。近年、ベクターISをより包括的に評価するアッセイ技術も導入されている。これらのアッセイは、Muトランスポゾン媒介PCR8、非限定的（nr）-LAM PCR9、タイプII制限酵素-m（re-free PCR） ^{12を用いて} 、ゲノムDNAを断片化し、ISを増幅させるために、遺伝子操作された消化¹⁰ 、機械的せん断¹¹ 、およびランダムヘキサマーベースのPCR現在の技術は、検出感度、ゲノムカバレッジ、標的特異性、ハイスループット容量、アッセイ手順の複雑さ、および標的部位の相対頻度の検出における偏りのレベルが様々である。既存のアッセイの様々な性質およびそれらが使用され得る様々な目的が与えられた場合、最適なアッセイ手法を注意深く選択する必要があります。

この作業では、統合された標的DNAの上流および下流を同時に解析することにより、検出率および配列定量精度を大幅に向上させる双方向アッセイの詳細な実験手順および計算データ解析ワークフローを提供します（図1を参照） ）。このアプローチはまた、レトロウイルス組み込みプロセス（例えば、標的部位重複の忠実度および上流および下流挿入のゲノム配列の変動）を特徴付ける手段である。他の双方向法は、標的DNA11,13,14の両端をクローニングおよび配列決定するために主に使用されている。このアッセイは、十分に確立されたLM-PCR法および計算解析マッピングを使用し、上流および下流接合部の両方を定量するために、ベクター標識クローンのハイスループットおよび再現性のある定量化のために広く最適化されている。 TaqαI酵素による双方向分析は、幹細胞遺伝子治療前臨床試験における高スループットクローン定量化に有用であることが証明されている2,15 。本稿では、より頻繁に使用されるカッター（RsaI / CviQI – モチーフ：GTAC）を用いて、tTaqαIに基づくアッセイと比較してインテグロムを検出する可能性がある。レンチウイルス（NL4.3およびその誘導体）およびガンマ – レトロウイルス（pMXベクター）ベクターIS分析にGTACモチーフ酵素を用いる詳細な実験およびデータ解析手順が記載されている。アッセイに用いたオリゴヌクレオチドを表1に列挙する。補遺資料には、IS配列解析のための社内プログラミングスクリプトが用意されています。