Bidirektionale Retrovirale Integrationsstelle PCR Methodik und quantitative Datenanalyse Workflow
Summary
Dieses Manuskript beschreibt die experimentelle Prozedur und Softwareanalyse für einen bidirektionalen Integrationsort-Assay, der gleichzeitig stromaufwärts und nachgeschaltete Vektor-Host-Junction-DNA analysieren kann. Bidirektionale PCR-Produkte können für jede nachgeschaltete Sequenzplattform eingesetzt werden. Die resultierenden Daten sind nützlich für einen hochdurchsatzreichen, quantitativen Vergleich von integrierten DNA-Targets.
Abstract
Integration Site (IS) Assays sind ein kritischer Bestandteil der Studie der retroviralen Integrationsstellen und ihrer biologischen Bedeutung. In den letzten retroviralen Gentherapie-Studien wurden IS-Assays in Kombination mit der Sequenzierung der nächsten Generation als Zell-Tracking-Tool verwendet, um klonale Stammzellpopulationen zu charakterisieren, die das gleiche IS teilen. Für den genauen Vergleich von repopulierenden Stammzellklonen innerhalb und über verschiedene Proben gehören die Nachweisempfindlichkeit, die Datenreproduzierbarkeit und die Hochdurchsatzkapazität des Assays zu den wichtigsten Assayqualitäten. Diese Arbeit bietet einen detaillierten Protokoll- und Datenanalyse-Workflow für die bidirektionale IS-Analyse. Der bidirektionale Assay kann gleichzeitig sowohl stromaufwärts als auch nachgeschaltete Vektor-Host-Übergänge abbilden. Im Vergleich zu konventionellen unidirektionalen IS-Sequenzierungsansätzen verbessert der bidirektionale Ansatz die IS-Erkennungsraten und die Charakterisierung von Integrationsereignissen an beiden Enden von tEr zielt auf DNA. Die hier beschriebene Datenanalyse-Pipeline identifiziert und zählt identische IS-Sequenzen durch mehrere Vergleichsschritte, die IS-Sequenzen auf das Referenzgenom abbilden und Sequenzfehler bestimmen. Mit einem optimierten Assayverfahren haben wir vor kurzem die detaillierten Wiederholungsmuster von Tausenden von Hämatopoetischen Stammzellen (HSC) Klonen nach Transplantation in Rhesusmakaken verabreicht und zeigen zum ersten Mal den genauen Zeitpunkt der HSC – Wiederbelegung und die funktionelle Heterogenität der HSCs in der Primasystem. Das folgende Protokoll beschreibt den Schritt-für-Schritt-experimentellen Prozedur- und Datenanalyse-Workflow, der identische IS-Sequenzen genau identifiziert und quantifiziert.
Introduction
Retroviren setzen ihre genomische DNA in das Wirtsgenom an verschiedenen Stellen ein. Diese einzigartige Eigenschaft, die zur Entwicklung von Krebs und anderen Formen der viralen Pathogenese beitragen kann, hat den ironischen Vorteil, diese Viren für die Zelltherapie für die Gentherapie und die Grundlagenforschung zugänglich zu machen. Die virale Integrationsstelle (IS) – der Standort auf dem Wirtsgenom, in dem eine fremde DNA (Virus) integriert ist – hat wichtige Implikationen für das Schicksal sowohl der integrierten Viren als auch der Wirtszellen. IS-Assays wurden in verschiedenen biologischen und klinischen Forschungsstufen verwendet, um die retrovirale Integrationssortierung und -pathogenese, die Krebsentwicklung, die Stammzellbiologie und die Entwicklungsbiologie 1 , 2 , 3 , 4 zu untersuchen. Niedrige Erkennungsempfindlichkeit, schlechte Datenreproduzierbarkeit und häufige Kreuzkontamination gehören dazuDie Schlüsselfaktoren, die die Anwendung von IS-Assays auf aktuelle und geplante Studien beschränken.
Es wurden viele IS-Analysetechnologien entwickelt. Restriktionsenzym-basierte Integrationsstellen-Assays, einschließlich Linker-vermittelte (LM) Polymerase-Kettenreaktion (PCR) 5 , inverse PCR 6 und Linear-Amplification-Mediated (LAM) PCR 7 , sind die am häufigsten verwendeten. Die Verwendung von ortsspezifischen Restriktionsenzymen erzeugt jedoch während des Abrufs des IS eine Vorspannung, die nur eine Teilmenge von Integromen (eine in das Wirtsgenom integrierte Fremd-DNA) in der Nähe der zu erholenden Restriktionsstelle erlaubt. In den letzten Jahren wurden auch Assay-Technologien eingeführt, die den Vektor IS umfassender beurteilen. Diese Assays verwenden verschiedene Strategien, einschließlich Mu transposonvermittelter PCR 8 , nichtrestriktives (nr) -LAM PCR 9 , Typ-II Restriktionsenzym-mDer abgetrennte Verdauung 10 , die mechanische Scherung 11 und die zufällige Hexamer-basierte PCR (Re-free PCR) 12 , um genomische DNAs zu zersplittern und IS zu verstärken. Die derzeitigen Technologien weisen unterschiedliche Erfassungsempfindlichkeiten, die Genomabdeckung, die Zielspezifität, die hohe Durchsatzkapazität, die Komplexität der Assayverfahren und die Vorspannung bei der Erfassung der relativen Frequenzen von Zielstellen auf. Angesichts der unterschiedlichen Qualitäten der vorhandenen Assays und der Vielfalt der Zwecke, für die sie verwendet werden können, sollte der optimale Assay-Ansatz sorgfältig ausgewählt werden.
Diese Arbeit liefert detaillierte experimentelle Verfahren und einen rechnerischen Datenanalyse-Workflow für einen bidirektionalen Assay, der die Erkennungsraten und die Sequenzquantifizierungsgenauigkeit durch gleichzeitiges Analysieren des IS stromaufwärts und stromabwärts der integrierten Ziel-DNA signifikant verbessert (siehe Abbildung 1 für eine schematische Ansicht der Assay-Verfahren ). Dieser Ansatz bietet auchS die Mittel, um den retroviralen Integrationsprozess zu charakterisieren (z. B. die Treue der Zielortduplikation und Variationen in den genomischen Sequenzen von Upstream- und Downstream-Insertionen). Andere bidirektionale Verfahren wurden hauptsächlich für die Klonierung und Sequenzierung beider Enden der Ziel-DNA 11 , 13 , 14 verwendet. Dieser Assay ist weitgehend optimiert für die Hochdurchsatz- und reproduzierbare Quantifizierung von Vektor-markierten Klonen unter Verwendung des etablierten LM-PCR-Verfahrens und der Rechenanalyse-Mapping und zur Quantifizierung sowohl der Upstream- als auch der Downstream-Junctions. Die bidirektionale Analyse mit dem TaqαI-Enzym hat sich für die Hochgeschwindigkeits-Clonal-Quantifizierung in der präklinischen Studie der Stammzell-Gentherapie als nützlich erwiesen 2 , 15 . Dieses Papier beschreibt eine modifizierte Methode mit einem häufiger Cutter (RsaI / CviQI – Motiv: GTAC), die t verdoppeltEr schätzt die Integrome im Vergleich zu einem TaqαI-basierten Assay . Detaillierte experimentelle und Datenanalyseverfahren, die GTAC-Motivenzyme für lentivirale (NL4.3 und ihre Derivate) und gamma-retrovirale (pMX-Vektoren) Vektor-IS-Analyse verwenden, werden beschrieben. Die in dem Assay verwendeten Oligonukleotide sind in Tabelle 1 aufgelistet. In dem ergänzenden Dokument ist ein eigenständiges Programmierskript für die IS-Sequenzanalyse enthalten.
Protocol
Representative Results
Discussion
Der bidirektionale Assay ermöglicht die gleichzeitige Analyse sowohl der vorgelagerten (links) als auch der stromabwärtigen (rechten) Vektor-Host-DNA-Junktionssequenzen und ist in einer Anzahl von Gentherapie-, Stammzell- und Krebsforschungsanwendungen nützlich. Die Verwendung von GTAC-Motiv-Enzymen (RsaI und CviQI) und der bidirektionale PCR-Ansatz verbessern signifikant die Chancen, eine Integrome (oder eine klonische Population) im Vergleich zu früheren TCGA-Motiv-Enzymen (TaqαI) -basierten Assays <sup class="xr…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Die Finanzierung erfolgte durch die National Institutes of Health Grants R00-HL116234, U19 AI117941 und R56 HL126544; Die National Science Foundation gewährt DMS-1516675; Die Nationale Forschungsstiftung von Korea (NRF-2011-0030049, NRF-2014M3C9A3064552); Und das KRIBB-Initiativprogramm.
Materials
| Thermostable DNA polymerase | Agilent | 600424 | PicoMaxx Polymerase |
| Thermostable DNA polymerase buffer | Agilent | 600424 | PicoMaxx Polymerase buffer |
| Deoxynucleotide (dNTP) solution mix | New England Biolabs | N0447L | dNTP solution mix (10mM each) |
| PCR tubes | VWR International | 53509-304 | PCR Strip Tubes With Individual Attached Caps |
| 2ml microcentrifuge tube | Molecular Bioproducts | 3453 | microcentrifuge tubes |
| PCR purification kit | Qiagen | 28106 | |
| RsaI | New England Biolabs | R0167L | restriction enzyme |
| CviQI | New England Biolabs | R0639L | restriction enzyme |
| Buffer A | New England Biolabs | B7204S | NEB CutSmart buffer |
| DNA Polymerase I large (klenow) fragment | New England Biolabs | M0210L | Blunting |
| streptavidin beads solution | Invitrogen | 60101 | Dynabeads kilobaseBINDER kit |
| Binding Solution | Invitrogen | 60101 | Dynabeads kilobaseBINDER kit |
| Washing Solution | Invitrogen | 60101 | Dynabeads kilobaseBINDER kit |
| magnetic stand | ThermoFisher | 12321D | DynaMag™-2 Magnet |
| T4 DNA ligase | New England Biolabs | M0202L | T4 DNA ligase |
| 10X T4 DNA ligase buffer | New England Biolabs | B0202S | T4 DNA ligase reaction buffer |
| 5X T4 DNA ligase buffer | Invitrogen | 46300-018 | T4 DNA ligase buffer with polyethylene glycol-8000 |
| UV-Vis spectrophotometer | Fisher Scientific | S06497 | Nanodrop 2000 |
| pvuII | new England Biolabs | R0151L | restriction enzyme |
| sfoI | new England Biolabs | R0606L | restriction enzyme |
| Buffer B | new England Biolabs | B7203S | NEB buffer 3.1 |
| Nuclease free water | Integrated DNA Technologies | 11-05-01-14 | |
| Capillary electrophoresis | Qiagen | 9001941 | QIAxcel capillary electrophoresis |
| Veriti 96-well Fast Thermal Cycler | Thermo Fisher Scientific | 4375305 | PCR Instrument |
| Rotating wheel (or Roller) | Eppendorf | M10534004 | Cell Culture Roller Drums |
| DNA size marker | Qiagen | 929559 | QX size marker (100-2,500 bp) |
| DNA size marker | Qiagen | 929554 | QX size marker (50-1,500 bp) |
| DNA alignment markers | Qiagen | 929524 | QX DNA Alignment Marker |
| genomc DNA | Not Available | Not Available | Sample genomc DNA from in vivo or in vitro experiments |
References
- Serrao, E., Engelman, A. N. Sites of Retroviral DNA Integration: From Basic Research to Clinical Applications. Crit. Rev. Biochem. Mol. Bio. 51 (1), 26-42 (2016).
- Kim, S., et al. Dynamics of HSPC Repopulation in Nonhuman Primates Revealed by a Decade-Long Clonal-Tracking Study. Cell Stem Cell. 14 (4), 473-485 (2014).
- Bushman, F. Retroviral integration and human gene therapy. J. Clin. Invest. 117 (8), 2083-2086 (2007).
- Bystrykh, L. V., Verovskaya, E., Zwart, E., Broekhuis, M., de Haan, G. Counting stem cells: methodological constraints. Nat Meth. 9 (6), 567-574 (2012).
- Schröder, A., et al. HIV-1 integration in the human genome favors active genes and local hotspots. Cell. 110 (4), 521-529 (2002).
- Silver, J., Keerikatte, V. Novel use of polymerase chain reaction to amplify cellular DNA adjacent to an integrated provirus. J. Virol. 64, 3150 (1990).
- Schmidt, M., et al. High-resolution insertion-site analysis by linear amplification-mediated PCR (LAM-PCR). Nat. Meth. 4 (12), 1051-1057 (2007).
- Brady, T., et al. A method to sequence and quantify DNA integration for monitoring outcome in gene therapy. Nucleic Acids Res. 39 (11), e72 (2011).
- Gabriel, R., et al. Comprehensive genomic access to vector integration in clinical gene therapy. Nat. Med. 15 (12), 1431-1436 (2009).
- Kim, S., Kim, Y., Liang, T., Sinsheimer, J., Chow, S. A high-throughput method for cloning and sequencing human immunodeficiency virus type 1 integration sites. J. Virol. 80 (22), 11313-11321 (2006).
- Maldarelli, F., et al. Specific HIV integration sites are linked to clonal expansion and persistence of infected cells. Science. 345 (6193), 179-183 (2014).
- Wu, C., et al. High Efficiency Restriction Enzyme-Free Linear Amplification-Mediated Polymerase Chain Reaction Approach for Tracking Lentiviral Integration Sites Does Not Abrogate Retrieval Bias. Hum. Gene. Ther. 24 (1), 38-47 (2013).
- Aker, M., Tubb, J., Miller, D. G., Stamatoyannopoulos, G., Emery, D. W. Integration Bias of Gammaretrovirus Vectors following Transduction and Growth of Primary Mouse Hematopoietic Progenitor Cells with and without Selection. Mol. Ther. 14 (2), 226-235 (2006).
- Gabriel, R., Kutschera, I., Bartholomae, C. C., von Kalle, C., Schmidt, M. Linear Amplification Mediated PCR; Localization of Genetic Elements and Characterization of Unknown Flanking DNA. J Vis Exp. (88), e51543 (2014).
- Kim, S., et al. High-throughput, sensitive quantification of repopulating hematopoietic stem cell clones. J. Virol. 84 (22), 11771-11780 (2010).
- Mitchell, R., et al. Retroviral DNA integration: ASLV, HIV, and MLV show distinct target site preferences. PLoS Biol. 2 (8), e234 (2004).
- Melkus, M., et al. Humanized mice mount specific adaptive and innate immune responses to EBV and TSST-1. Nat. Med. 12 (11), 1316-1322 (2006).
- Bystrykh, L. V. A combinatorial approach to the restriction of a mouse genome. BMC Res Notes. 6, 284 (2013).
- Beard, B. C., Adair, J. E., Trobridge, G. D., Kiem, H. -. P. High-throughput genomic mapping of vector integration sites in gene therapy studies. Methods Mol Biol. , 321-344 (2014).
- Gabriel, R., et al. Comprehensive genomic access to vector integration in clinical gene therapy. Nat. Med. 15 (12), 1431-1436 (2009).
- Qin, X., An, D., Chen, I., Baltimore, D. Inhibiting HIV-1 infection in human T cells by lentiviral-mediated delivery of small interfering RNA against CCR5. Proc Natl Acad Sci U S A. 100 (1), 183-188 (2003).
- Kitamura, T., et al. Retrovirus-mediated gene transfer and expression cloning: powerful tools in functional genomics. Exp. Hematol. 31 (11), 1007-1014 (2003).
- Cartier, N., et al. Hematopoietic stem cell gene therapy with a lentiviral vector in X-linked adrenoleukodystrophy. Science. 326 (5954), 818-823 (2009).
