Çift Yönlü Retroviral Entegrasyon Sitesi PCR Metodolojisi ve Kantitatif Veri Analizi İş Akışı
Summary
Bu el yazması, aynı anda yukarı akış ve aşağı akış vektör-konakçı bağlantı DNA'sını analiz edebilen çift yönlü bir entegrasyon alanı tahlilinin deneysel prosedürünü ve yazılım analizini anlatmaktadır. Çift yönlü PCR ürünleri, herhangi bir aşağı akım sıralama platformu için kullanılabilir. Ortaya çıkan veriler, entegre DNA hedeflerinin yüksek verimli, niceliksel bir karşılaştırması için kullanışlıdır.
Abstract
Entegrasyon Siteleri (IS) tahlilleri, retroviral entegrasyon sitelerinin incelenmesinin ve biyolojik öneminin kritik bir bileşenidir. Yeni retroviral gen terapi çalışmalarında, IS testleri, yeni nesil sıralama ile birlikte, aynı IS'yi paylaşan klonal kök hücre popülasyonlarının karakterize edilmesi için bir hücre izleme aracı olarak kullanılmıştır. Farklı örnekler içindeki ve üzerinde yeniden popülasyon kök hücre klonlarının doğru bir şekilde karşılaştırılması için, tahlil hassasiyeti, veri tekrarlanabilirliği ve tahlilin yüksek verim kapasitesi, en önemli deney kalitesi arasındadır. Bu çalışma, iki yönlü IS analizi için ayrıntılı bir protokol ve veri analizi iş akışı sağlar. İki yönlü test, aynı anda hem yukarı akış hem de aşağı doğru vektör-konak kavşaklarını sıralayabilir. Geleneksel tek yönlü IS sıralama yaklaşımlarıyla karşılaştırıldığında, iki yönlü yaklaşım IS bulma oranlarını önemli ölçüde geliştirir ve t her iki ucundaki entegrasyon olaylarının karakterizasyonuDNA'yı hedef alıyor. Burada açıklanan veri analizi boru hattı, IS dizilerinin referans genom üzerine eşlendiği ve sıralama hatalarını belirleyen çok sayıda karşılaştırma adımıyla özdeş IS dizilerini doğru olarak tanımlar ve numaralandırır. Optimize edilmiş bir analiz prosedürü kullanarak son zamanlarda binlerce Hematopoietik Kök Hücre (HSC) klonunun rhesus makaklarda transplantasyonun ayrıntılı repopülasyon kalıplarını yayınladık ve ilk kez HSC repopülasyonunun kesin zaman noktasını ve HSC reprodüksiyonunun fonksiyonel heterojenliğini gösterdik. Primat sistemi. Aşağıdaki protokol, özdeş IS dizilerini doğru olarak tanımlayan ve nicelik kazandıran adım adım deneysel işlem ve veri analizi iş akışını tanımlar.
Introduction
Retrovirüsler, genomik DNA'larını çeşitli yerlerde konukçu genomuna yerleştirir. Kanserlerin ve viral patogenezin diğer formlarının gelişmesine katkıda bulunabilecek bu benzersiz mülk, bu virüsleri, gen terapisi ve temel biyoloji araştırmaları için hücresel mühendisliğe oldukça uysal hale getirmenin ironik yararımına sahiptir. Viral Entegrasyon Sitesi (İS) – yabancı bir DNA'nın (virüsün) entegre olduğu konak genomu üzerindeki yeri hem entegre virüslerin hem de konakçı hücrelerin kaderi için önemli etkilere sahiptir. IS tahlilleri, retroviral entegrasyon bölgesi seçimini ve patogenezini, kanser gelişimini, kök hücre biyolojisini ve gelişimsel biyolojiyi incelemek için çeşitli biyolojik ve klinik araştırmalar ortamında kullanılmıştır. 1 , 2 , 3 , 4 . Düşük algılama hassasiyeti, zayıf veri tekrarlanabilirliği ve sıkça çapraz bulaşmaIS tahlillerinin mevcut ve planlanan çalışmalara uygulanmasını sınırlayan başlıca faktörler.
Pek çok IS analiz teknolojisi geliştirildi. Bağlayıcı-Aracılı (LM) Polimeraz Zincir Reaksiyonu (PCR) 5 , ters PCR 6 ve Lineer-Amplifikasyon-Aracılaştırılmış (LAM) PCR 7 dahil olmak üzere sınırlama enzimine dayalı entegrasyon bölgesi testleri en çok kullanılanlardır. Bununla birlikte, alana özgü kısıtlama enzimlerinin kullanılması, IS'nin alınması esnasında bir önyargı üretir ve kısıtlama bölgesi çevresinde yalnızca integromların bir alt kümesinin (konakçı genomuna entegre edilmiş yabancı bir DNA'nın) elde edilmesine izin verir 4 . Vektör IS'yi daha kapsamlı olarak değerlendiren tahlil teknolojileri de son yıllarda tanıtıldı. Bu tahliller, Mu transpozon aracılı PCR 8 , nonrestrictif (nr) -LAM PCR 9 , tip-II kısıtlama enzimi-m( 10) , mekanik kesme ( 11 ) ve genomik DNA'ları parçalamak için Rasgele Heksamer'e Dayalı PCR (Re-free PCR) ( 12 ) kullanılarak çoğaltılabilir. Mevcut teknolojiler, tespit hassasiyeti, genom kapsama alanı, hedef özgünlüğü, yüksek verimli kapasite, analiz prosedürlerinin karmaşıklığı ve hedef bölgelerin göreceli frekanslarının saptanmasında önyargılar olmak üzere farklı seviyelerde değişir. Mevcut tahlillerdeki değişen nitelikler ve bunların kullanılabileceği çeşitli amaçlar göz önüne alındığında, optimal tahlil yaklaşımı dikkatle seçilmelidir.
Bu çalışma, entegre hedef DNA'nın yukarı akış ve akış aşağısında eşzamanlı olarak analiz ederek bulma hızlarını ve dizi nicelik doğruluğunu önemli ölçüde geliştiren çift yönlü bir analiz için ayrıntılı deneysel prosedürleri ve hesaplama veri analizi iş akışını sağlar (bakınız, tahlil prosedürlerinin şematik bir görünümü için Şekil 1). ). Bu yaklaşım aynı zamandaRetroviral entegrasyon sürecini karakterize etmek için araçlar (örneğin, hedef bölge duplikasyonunun geçerliliği ve yukarı akış ve aşağı akış eklemelerinin genomik sekanslarındaki değişiklikler). Diğer iki yönlü yöntemler öncelikle hedef DNA 11 , 13 , 14'ün her iki ucunun klonlanması ve dizilmesi için kullanılmıştır. Bu tahlil, iyi kurulmuş LM-PCR yöntemi ve hesaplama analizi haritalaması kullanılarak ve hem yukarı hem de aşağı doğru kavşakların nicelleştirilmesi için vektör işaretli klonların yüksek verimli ve tekrarlanabilir kantifikasyonu için kapsamlı şekilde optimize edilmiştir. TaqαI enzimi ile çift yönlü analiz, klinik öncesi çalışmalar 2 , 15'de kök hücre gen tedavisinde yüksek verimli klonal niceleme için yararlı olduğu kanıtlanmıştır. Bu makale, daha sık kesici (RsaI / CviQI – motif: GTAC) kullanılarak tTaqαI tabanlı bir teste kıyasla integromlar tespit etme şansı . Lentiviral (NL4.3 ve türevleri) ve gamma-retroviral (pMX vektörleri) vektör IS analizi için GTAC motif enzimlerini kullanan ayrıntılı deneysel ve veri analizi işlemleri anlatılmıştır. Deneyde kullanılan oligonükleotidler Tablo 1'de listelenmiştir. IS dizisi analizi için bir dahili programlama betiği ek belgede sağlanmaktadır.
Protocol
Representative Results
Discussion
Çift yönlü analiz hem yukarı akış (sol) hem de akış aşağı (sağ) vektör-konak DNA birleştirici dizilerinin eşzamanlı analizini mümkün kılar ve bir dizi gen terapisi, kök hücre ve kanser araştırma uygulamaları için yararlıdır. GTAC motif enzimlerinin (RsaI ve CviQI) ve çift yönlü PCR yaklaşımının kullanılması, önceki TCGA motif enzimine ( TaqαI ) dayalı tahliller 2 , 15 ve diğerlerine kıy…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Finansman, Ulusal Sağlık Teşvik Kuruluşları R00-HL116234, U19 AI117941 ve R56 HL126544 tarafından sağlandı; Ulusal Bilim Vakfı Grant DMS-1516675; Kore Ulusal Araştırma Vakfı (NRF-2011-0030049, NRF-2014M3C9A3064552); Ve KRIBB girişim programı.
Materials
| Thermostable DNA polymerase | Agilent | 600424 | PicoMaxx Polymerase |
| Thermostable DNA polymerase buffer | Agilent | 600424 | PicoMaxx Polymerase buffer |
| Deoxynucleotide (dNTP) solution mix | New England Biolabs | N0447L | dNTP solution mix (10mM each) |
| PCR tubes | VWR International | 53509-304 | PCR Strip Tubes With Individual Attached Caps |
| 2ml microcentrifuge tube | Molecular Bioproducts | 3453 | microcentrifuge tubes |
| PCR purification kit | Qiagen | 28106 | |
| RsaI | New England Biolabs | R0167L | restriction enzyme |
| CviQI | New England Biolabs | R0639L | restriction enzyme |
| Buffer A | New England Biolabs | B7204S | NEB CutSmart buffer |
| DNA Polymerase I large (klenow) fragment | New England Biolabs | M0210L | Blunting |
| streptavidin beads solution | Invitrogen | 60101 | Dynabeads kilobaseBINDER kit |
| Binding Solution | Invitrogen | 60101 | Dynabeads kilobaseBINDER kit |
| Washing Solution | Invitrogen | 60101 | Dynabeads kilobaseBINDER kit |
| magnetic stand | ThermoFisher | 12321D | DynaMag™-2 Magnet |
| T4 DNA ligase | New England Biolabs | M0202L | T4 DNA ligase |
| 10X T4 DNA ligase buffer | New England Biolabs | B0202S | T4 DNA ligase reaction buffer |
| 5X T4 DNA ligase buffer | Invitrogen | 46300-018 | T4 DNA ligase buffer with polyethylene glycol-8000 |
| UV-Vis spectrophotometer | Fisher Scientific | S06497 | Nanodrop 2000 |
| pvuII | new England Biolabs | R0151L | restriction enzyme |
| sfoI | new England Biolabs | R0606L | restriction enzyme |
| Buffer B | new England Biolabs | B7203S | NEB buffer 3.1 |
| Nuclease free water | Integrated DNA Technologies | 11-05-01-14 | |
| Capillary electrophoresis | Qiagen | 9001941 | QIAxcel capillary electrophoresis |
| Veriti 96-well Fast Thermal Cycler | Thermo Fisher Scientific | 4375305 | PCR Instrument |
| Rotating wheel (or Roller) | Eppendorf | M10534004 | Cell Culture Roller Drums |
| DNA size marker | Qiagen | 929559 | QX size marker (100-2,500 bp) |
| DNA size marker | Qiagen | 929554 | QX size marker (50-1,500 bp) |
| DNA alignment markers | Qiagen | 929524 | QX DNA Alignment Marker |
| genomc DNA | Not Available | Not Available | Sample genomc DNA from in vivo or in vitro experiments |
References
- Serrao, E., Engelman, A. N. Sites of Retroviral DNA Integration: From Basic Research to Clinical Applications. Crit. Rev. Biochem. Mol. Bio. 51 (1), 26-42 (2016).
- Kim, S., et al. Dynamics of HSPC Repopulation in Nonhuman Primates Revealed by a Decade-Long Clonal-Tracking Study. Cell Stem Cell. 14 (4), 473-485 (2014).
- Bushman, F. Retroviral integration and human gene therapy. J. Clin. Invest. 117 (8), 2083-2086 (2007).
- Bystrykh, L. V., Verovskaya, E., Zwart, E., Broekhuis, M., de Haan, G. Counting stem cells: methodological constraints. Nat Meth. 9 (6), 567-574 (2012).
- Schröder, A., et al. HIV-1 integration in the human genome favors active genes and local hotspots. Cell. 110 (4), 521-529 (2002).
- Silver, J., Keerikatte, V. Novel use of polymerase chain reaction to amplify cellular DNA adjacent to an integrated provirus. J. Virol. 64, 3150 (1990).
- Schmidt, M., et al. High-resolution insertion-site analysis by linear amplification-mediated PCR (LAM-PCR). Nat. Meth. 4 (12), 1051-1057 (2007).
- Brady, T., et al. A method to sequence and quantify DNA integration for monitoring outcome in gene therapy. Nucleic Acids Res. 39 (11), e72 (2011).
- Gabriel, R., et al. Comprehensive genomic access to vector integration in clinical gene therapy. Nat. Med. 15 (12), 1431-1436 (2009).
- Kim, S., Kim, Y., Liang, T., Sinsheimer, J., Chow, S. A high-throughput method for cloning and sequencing human immunodeficiency virus type 1 integration sites. J. Virol. 80 (22), 11313-11321 (2006).
- Maldarelli, F., et al. Specific HIV integration sites are linked to clonal expansion and persistence of infected cells. Science. 345 (6193), 179-183 (2014).
- Wu, C., et al. High Efficiency Restriction Enzyme-Free Linear Amplification-Mediated Polymerase Chain Reaction Approach for Tracking Lentiviral Integration Sites Does Not Abrogate Retrieval Bias. Hum. Gene. Ther. 24 (1), 38-47 (2013).
- Aker, M., Tubb, J., Miller, D. G., Stamatoyannopoulos, G., Emery, D. W. Integration Bias of Gammaretrovirus Vectors following Transduction and Growth of Primary Mouse Hematopoietic Progenitor Cells with and without Selection. Mol. Ther. 14 (2), 226-235 (2006).
- Gabriel, R., Kutschera, I., Bartholomae, C. C., von Kalle, C., Schmidt, M. Linear Amplification Mediated PCR; Localization of Genetic Elements and Characterization of Unknown Flanking DNA. J Vis Exp. (88), e51543 (2014).
- Kim, S., et al. High-throughput, sensitive quantification of repopulating hematopoietic stem cell clones. J. Virol. 84 (22), 11771-11780 (2010).
- Mitchell, R., et al. Retroviral DNA integration: ASLV, HIV, and MLV show distinct target site preferences. PLoS Biol. 2 (8), e234 (2004).
- Melkus, M., et al. Humanized mice mount specific adaptive and innate immune responses to EBV and TSST-1. Nat. Med. 12 (11), 1316-1322 (2006).
- Bystrykh, L. V. A combinatorial approach to the restriction of a mouse genome. BMC Res Notes. 6, 284 (2013).
- Beard, B. C., Adair, J. E., Trobridge, G. D., Kiem, H. -. P. High-throughput genomic mapping of vector integration sites in gene therapy studies. Methods Mol Biol. , 321-344 (2014).
- Gabriel, R., et al. Comprehensive genomic access to vector integration in clinical gene therapy. Nat. Med. 15 (12), 1431-1436 (2009).
- Qin, X., An, D., Chen, I., Baltimore, D. Inhibiting HIV-1 infection in human T cells by lentiviral-mediated delivery of small interfering RNA against CCR5. Proc Natl Acad Sci U S A. 100 (1), 183-188 (2003).
- Kitamura, T., et al. Retrovirus-mediated gene transfer and expression cloning: powerful tools in functional genomics. Exp. Hematol. 31 (11), 1007-1014 (2003).
- Cartier, N., et al. Hematopoietic stem cell gene therapy with a lentiviral vector in X-linked adrenoleukodystrophy. Science. 326 (5954), 818-823 (2009).
