דו כיווני Retroviral אינטגרציה אתר PCR מתודולוגיה וניתוח נתונים כמותיים זרימת עבודה
Summary
כתב יד זה מתאר את הליך הניסוי וניתוח תוכנה עבור assay דו כיווני האתר אינטגרציה שיכולה בו זמנית לנתח במעלה הזרם ו-במורד הזרם ווקטור צומת ה- DNA. ניתן להשתמש במוצרי PCR דו-כיווניים עבור כל פלטפורמה של רצף דונסטרים. הנתונים שהתקבלו שימושיים עבור השוואה גבוהה, השוואה כמותית של מטרות DNA משולב.
Abstract
מבחני אינטגרציית האתר (IS) הם מרכיב קריטי בחקר אתרי אינטגרציה רטרו-ויראליים ומשמעותם הביולוגית. במחקרים שנעשו לאחרונה על גנים רטרו-ויראליים, מבחני ה- IS, בשילוב עם רצף הדור הבא, שימשו ככלי למעקב תאים כדי לאפיין אוכלוסיות של תאי גזע משובטים החולקים את אותו ה- IS. לשם השוואה מדויקת של repopulating שיבוטים תא גזע בתוך דגימות שונות, זיהוי רגישות, שחזור נתונים, קיבולת תפוקה גבוהה של assay הן בין התכונות assay החשוב ביותר. עבודה זו מספקת פרוטוקול מפורט ונתונים ניתוח עבודה עבור ניתוח דו כיוונית IS. Assay דו כיווני יכול במקביל רצף הן במעלה או במורד הזרם ווקטור מארח צמתים. בהשוואה גישות חד צדדית קונבנציונאלי IS רצף, הגישה דו כיוונית משפר באופן משמעותי את שיעורי גילוי ה- IS ואת אפיון של אירועים אינטגרציה בשני הקצוות של tהוא מכוון לדנ"א. צינור ניתוח הנתונים המתואר כאן מזהה ומזהה במדויק רצפים IS זהה באמצעות שלבים מרובים של השוואה כי מפת מסלולים IS על הגנום התייחסות ולקבוע שגיאות רצף. באמצעות הליך אופטימיזציה assay, יש לנו פירסם לאחרונה את דפוסי repopulation מפורט של אלפי שיבוט תאים גזעית hematopoietic (HSC) שיבוטים הבאים השתלה ב macacques rsus, מפגין בפעם הראשונה את נקודת הזמן המדויקת של HSC repopulation ואת ההטרוגניות תפקודית של HSCs ב מערכת הפרימטים. הפרוטוקול הבא מתאר את ההליך הניסוי שלב אחר שלב ואת זרימת עבודה ניתוח נתונים המזהה ומזהה במדויק רצפים IS זהה.
Introduction
רטרווירוסים מכניסים את הדנ"א הגנומי שלהם לגנום המארח באתרים שונים. תכונה ייחודית זו, אשר עשויה לתרום להתפתחות סרטן וצורות אחרות של פתוגנזה ויראלית, יש יתרון אירוני של הפיכת וירוסים אלה מקובלות מאוד להנדסה סלולרית עבור טיפול גנטי ומחקר ביולוגי בסיסי. אתר האינטגרציה הנגיפי (IS) – המיקום על הגנום המארח שבו משולב דנ"א זר (וירוס) – יש השלכות חשובות על גורלם של הנגיפים המשולבים ושל התאים המארחים. מבחני ה- IS שימשו בהגדרות מחקר ביולוגיות וקליניות שונות על מנת לבחון את הבחירה באתר האינטגרציה הרטרו-ויראלית והפתוגנזה, התפתחות סרטן, ביולוגיה של תאי גזע וביולוגיה התפתחותית 1 , 2 , 3 , 4 . רגישות נמוכה לזיהוי, שחזור נתונים לקוי, וזיהום צולב תכופים הם ביןהגורמים המרכזיים להגבלת היישומים של מבחני ה- IS למחקרים הנוכחיים והמתוכננים.
הרבה טכנולוגיות ניתוח IS פותחו. הגבלת אנזימים מבוססי מבחני אינטגרציה האתר, כולל קישור LM) פולימרז שרשרת התגובה (PCR) 5 , הפוך PCR 6 , ו-ליניארי הגברה- Mediated (LAM) PCR 7 , הם הנפוצים ביותר. עם זאת, השימוש באנזימי הגבלה ספציפיים לאתר, יוצר הטיה בזמן אחזור ה- IS, ומאפשר רק תת-קבוצה של אינטגרומים (DNA זר המשולב בגנום המארח) בקרבת אתר ההגבלה שיש לשחזר. טכנולוגיות Assay כי הערכה מקיפה יותר וקטור IS כבר הציג בשנים האחרונות. מבחני אלה להעסיק אסטרטגיות שונות, כולל מו טרנספוזון בתיווך PCR 8 , nonrrictive (nr) -LAM PCR 9 , סוג II הגבלת אנזים-מ 'עיבוד מעבדה 10 , גז מכני 11 , ו – PCR אקראיים מבוססי hexamer (Re-free PCR) 12 , לרסס DNAs גנומי ולהגדיל את ה- IS. הטכנולוגיות הנוכחיות יש רמות משתנות של רגישות זיהוי, כיסוי הגנום, ספציפיות היעד, קיבולת תפוקה גבוהה, המורכבות של הליכי assay, ואת הטיות בזיהוי התדרים היחסיים של אתרי היעד. בהתחשב בתכונות שונות של מבחני הקיימים מגוון של מטרות אשר ניתן להשתמש בהם, הגישה assay אופטימלי צריך להיות נבחר בקפידה.
עבודה זו מספקת נהלים ניסויים מפורט זרימת עבודה ניתוח נתונים חישובית עבור assay דו כיווני זה משפר באופן משמעותי את שיעורי גילוי ורמת כימות רצף על ידי ניתוח בו זמנית במעלה הזרם של הזרם של DNA משולב היעד (ראה איור 1 עבור תצוגה סכמטית של הליכי assay ). גישה זו גם לספק(לדוגמה, הנאמנות של שכפול אתר היעד ווריאציות ברצף הגנומי של הזרמות במעלה או במורד הזרם). שיטות דו-כיווניות אחרות שימשו בעיקר לשיבוט ולרצף של שני הקצוות של היעד DNA 11 , 13 , 14 . Assay זה מותאם באופן מיטבי עבור התפוקה גבוהה לשעתקו לשחזור של שיבוטים מסומנים וקטור, תוך שימוש בשיטת LM-PCR מבוססת היטב ומיפוי ניתוח חישובית, וכן לכימות שני צמתים במעלה או במורד. אנליזה דו-כיוונית עם האנזים TaqαI הוכיחה את עצמה עבור כימות גבוהה של התפוקה המשובצת בתאי גזע גזעניים מחקרים פרה-קליניים 2 , 15 . מאמר זה מתאר שיטה שונה באמצעות חותך תכופים יותר (RsaI / CviQI – מוטיב: GTAC), אשר מכפילההוא הסיכויים של גילוי integromes לעומת assay TaqαI מבוסס . ניסויים מפורטים וניתוח נתונים אשר משתמשים אנזימים מוטיב GTAC עבור lentiviral (NL4.3 ו נגזרותיה) ו גמא raterroviral (pMX וקטורים) וקטור IS ניתוח מתוארים. Oligonucleotides בשימוש assay המפורטים בטבלה 1 . סקריפט תכנות פנימי עבור ניתוח רצף IS מסופק במסמך המשלים.
Protocol
Representative Results
Discussion
Assay דו כיווני מאפשר ניתוח סימולטני של שניהם במעלה הזרם (שמאל) ומורד הזרם (מימין) וקטור רצפים רצף DNA והוא שימושי במספר טיפולים גנטיים, תאי גזע, ויישומים מחקר סרטן. השימוש באנזימים של GTAC-Motif (RSAI ו- CviQI) וגישת ה- PCR הדו-כיוונית משפרת באופן משמעותי את הסיכוי לגילוי אינטגרום (או ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
המימון ניתן על ידי המוסדות הלאומיים לבריאות מענקים R00-HL116234, U19 A191141, R56 HL126544; הקרן הלאומית למדע גרנט DMS-1516675; הקרן הלאומית למחקר של קוריאה (NRF-2011-0030049, NRF-2014M3C9A3064552); ואת תוכנית היוזמה KRIBB.
Materials
| Thermostable DNA polymerase | Agilent | 600424 | PicoMaxx Polymerase |
| Thermostable DNA polymerase buffer | Agilent | 600424 | PicoMaxx Polymerase buffer |
| Deoxynucleotide (dNTP) solution mix | New England Biolabs | N0447L | dNTP solution mix (10mM each) |
| PCR tubes | VWR International | 53509-304 | PCR Strip Tubes With Individual Attached Caps |
| 2ml microcentrifuge tube | Molecular Bioproducts | 3453 | microcentrifuge tubes |
| PCR purification kit | Qiagen | 28106 | |
| RsaI | New England Biolabs | R0167L | restriction enzyme |
| CviQI | New England Biolabs | R0639L | restriction enzyme |
| Buffer A | New England Biolabs | B7204S | NEB CutSmart buffer |
| DNA Polymerase I large (klenow) fragment | New England Biolabs | M0210L | Blunting |
| streptavidin beads solution | Invitrogen | 60101 | Dynabeads kilobaseBINDER kit |
| Binding Solution | Invitrogen | 60101 | Dynabeads kilobaseBINDER kit |
| Washing Solution | Invitrogen | 60101 | Dynabeads kilobaseBINDER kit |
| magnetic stand | ThermoFisher | 12321D | DynaMag™-2 Magnet |
| T4 DNA ligase | New England Biolabs | M0202L | T4 DNA ligase |
| 10X T4 DNA ligase buffer | New England Biolabs | B0202S | T4 DNA ligase reaction buffer |
| 5X T4 DNA ligase buffer | Invitrogen | 46300-018 | T4 DNA ligase buffer with polyethylene glycol-8000 |
| UV-Vis spectrophotometer | Fisher Scientific | S06497 | Nanodrop 2000 |
| pvuII | new England Biolabs | R0151L | restriction enzyme |
| sfoI | new England Biolabs | R0606L | restriction enzyme |
| Buffer B | new England Biolabs | B7203S | NEB buffer 3.1 |
| Nuclease free water | Integrated DNA Technologies | 11-05-01-14 | |
| Capillary electrophoresis | Qiagen | 9001941 | QIAxcel capillary electrophoresis |
| Veriti 96-well Fast Thermal Cycler | Thermo Fisher Scientific | 4375305 | PCR Instrument |
| Rotating wheel (or Roller) | Eppendorf | M10534004 | Cell Culture Roller Drums |
| DNA size marker | Qiagen | 929559 | QX size marker (100-2,500 bp) |
| DNA size marker | Qiagen | 929554 | QX size marker (50-1,500 bp) |
| DNA alignment markers | Qiagen | 929524 | QX DNA Alignment Marker |
| genomc DNA | Not Available | Not Available | Sample genomc DNA from in vivo or in vitro experiments |
References
- Serrao, E., Engelman, A. N. Sites of Retroviral DNA Integration: From Basic Research to Clinical Applications. Crit. Rev. Biochem. Mol. Bio. 51 (1), 26-42 (2016).
- Kim, S., et al. Dynamics of HSPC Repopulation in Nonhuman Primates Revealed by a Decade-Long Clonal-Tracking Study. Cell Stem Cell. 14 (4), 473-485 (2014).
- Bushman, F. Retroviral integration and human gene therapy. J. Clin. Invest. 117 (8), 2083-2086 (2007).
- Bystrykh, L. V., Verovskaya, E., Zwart, E., Broekhuis, M., de Haan, G. Counting stem cells: methodological constraints. Nat Meth. 9 (6), 567-574 (2012).
- Schröder, A., et al. HIV-1 integration in the human genome favors active genes and local hotspots. Cell. 110 (4), 521-529 (2002).
- Silver, J., Keerikatte, V. Novel use of polymerase chain reaction to amplify cellular DNA adjacent to an integrated provirus. J. Virol. 64, 3150 (1990).
- Schmidt, M., et al. High-resolution insertion-site analysis by linear amplification-mediated PCR (LAM-PCR). Nat. Meth. 4 (12), 1051-1057 (2007).
- Brady, T., et al. A method to sequence and quantify DNA integration for monitoring outcome in gene therapy. Nucleic Acids Res. 39 (11), e72 (2011).
- Gabriel, R., et al. Comprehensive genomic access to vector integration in clinical gene therapy. Nat. Med. 15 (12), 1431-1436 (2009).
- Kim, S., Kim, Y., Liang, T., Sinsheimer, J., Chow, S. A high-throughput method for cloning and sequencing human immunodeficiency virus type 1 integration sites. J. Virol. 80 (22), 11313-11321 (2006).
- Maldarelli, F., et al. Specific HIV integration sites are linked to clonal expansion and persistence of infected cells. Science. 345 (6193), 179-183 (2014).
- Wu, C., et al. High Efficiency Restriction Enzyme-Free Linear Amplification-Mediated Polymerase Chain Reaction Approach for Tracking Lentiviral Integration Sites Does Not Abrogate Retrieval Bias. Hum. Gene. Ther. 24 (1), 38-47 (2013).
- Aker, M., Tubb, J., Miller, D. G., Stamatoyannopoulos, G., Emery, D. W. Integration Bias of Gammaretrovirus Vectors following Transduction and Growth of Primary Mouse Hematopoietic Progenitor Cells with and without Selection. Mol. Ther. 14 (2), 226-235 (2006).
- Gabriel, R., Kutschera, I., Bartholomae, C. C., von Kalle, C., Schmidt, M. Linear Amplification Mediated PCR; Localization of Genetic Elements and Characterization of Unknown Flanking DNA. J Vis Exp. (88), e51543 (2014).
- Kim, S., et al. High-throughput, sensitive quantification of repopulating hematopoietic stem cell clones. J. Virol. 84 (22), 11771-11780 (2010).
- Mitchell, R., et al. Retroviral DNA integration: ASLV, HIV, and MLV show distinct target site preferences. PLoS Biol. 2 (8), e234 (2004).
- Melkus, M., et al. Humanized mice mount specific adaptive and innate immune responses to EBV and TSST-1. Nat. Med. 12 (11), 1316-1322 (2006).
- Bystrykh, L. V. A combinatorial approach to the restriction of a mouse genome. BMC Res Notes. 6, 284 (2013).
- Beard, B. C., Adair, J. E., Trobridge, G. D., Kiem, H. -. P. High-throughput genomic mapping of vector integration sites in gene therapy studies. Methods Mol Biol. , 321-344 (2014).
- Gabriel, R., et al. Comprehensive genomic access to vector integration in clinical gene therapy. Nat. Med. 15 (12), 1431-1436 (2009).
- Qin, X., An, D., Chen, I., Baltimore, D. Inhibiting HIV-1 infection in human T cells by lentiviral-mediated delivery of small interfering RNA against CCR5. Proc Natl Acad Sci U S A. 100 (1), 183-188 (2003).
- Kitamura, T., et al. Retrovirus-mediated gene transfer and expression cloning: powerful tools in functional genomics. Exp. Hematol. 31 (11), 1007-1014 (2003).
- Cartier, N., et al. Hematopoietic stem cell gene therapy with a lentiviral vector in X-linked adrenoleukodystrophy. Science. 326 (5954), 818-823 (2009).
