Tweerichtings retrovirale integratie site PCR methodologie en kwantitatieve data analyse werkstroom
Summary
Dit manuscript beschrijft de experimentele procedure en software analyse voor een bidirectionele integratie site analyse die tegelijkertijd upstream en downstream vector-host junction DNA kan analyseren. Bidirectionele PCR producten kunnen worden gebruikt voor elk downstream sequencing platform. De resulterende gegevens zijn bruikbaar voor een high-throughput, kwantitatieve vergelijking van geïntegreerde DNA-doelen.
Abstract
Integratie Site (IS) analyses zijn een kritisch onderdeel van de studie van retrovirale integratie sites en hun biologische betekenis. In recente retrovirale gentherapie studies zijn IS-assays, in combinatie met sequentie van volgende generatie, gebruikt als een cel-tracking tool om clonale stamcelpopulaties te identificeren die dezelfde IS delen. Voor de nauwkeurige vergelijking van repopulerende stamcelklonen binnen en over verschillende monsters, zijn de detectiegevoeligheid, data reproduceerbaarheid en hoge doorvoercapaciteit van de assay een van de belangrijkste analysekwaliteiten. Dit werk biedt een gedetailleerd protocol- en data-analyse workflow voor bidirectionele IS analyse. De bidirectionele assay kan tegelijkertijd zowel stroomopwaartse als stroomafwaartse vector-gastheerverbindingen ordenen. Vergeleken met conventionele unidirectionele IS sequencing benaderingen, verbetert de bidirectionele aanpak de detectiesnelheden van IS en de karakterisering van integratie gebeurtenissen aan beide einden van tHij richt zich op DNA. De hier beschreven gegevensanalysepijplijn identificeert en noemt identieke IS-sequenties door meerdere stappen van vergelijking die de kaart IS sequenties op het referentiegenoom en sequentiefouten bepalen. Met behulp van een geoptimaliseerde testprocedure hebben we onlangs de gedetailleerde repopulatiepatronen van duizenden Hematopoietische Stamcellen (HSC) klonen gepubliceerd na transplantatie in rhesus macaques, die voor het eerst het exacte tijdspunt van HSC-repopulatie en de functionele heterogeniteit van HSC's in de Primaat systeem. Het volgende protocol beschrijft de stap-voor-stap experimentele procedure en data-analyse workflow die identieke IS sequenties nauwkeurig identificeert en kwantificeert.
Introduction
Retrovirussen zetten hun genomische DNA in het gastheergenoom op verschillende plaatsen in. Deze unieke eigenschap, die kan bijdragen tot de ontwikkeling van kanker en andere vormen van virale pathogenese, heeft het ironische voordeel dat deze virussen zeer toegankelijk zijn voor cellulaire engineering voor gentherapie en basisbiologisch onderzoek. De virale integratieplaats (IS) – de locatie op het gastheergenoom waarin een vreemd DNA (virus) is geïntegreerd – heeft belangrijke implicaties voor het lot van zowel de geïntegreerde virussen als de gastheercellen. IS-analyses zijn gebruikt in verschillende biologische en klinische onderzoeksinstellingen om retrovirale integratie site selectie en pathogenese, kankerontwikkeling, stamcelbiologie en ontwikkelingsbiologie 1 , 2 , 3 , 4 te bestuderen. Geringe detectie gevoeligheid, slechte data reproduceerbaarheid, en frequente cross-contaminatie zijn onderDe belangrijkste factoren die de toepassingen van IS-analyses beperken tot huidige en geplande studies.
Er zijn veel IS-analysetechnologieën ontwikkeld. Restrictie-enzym gebaseerde integratie site assays, waaronder Linker-Gemedieerde (LM) Polymerase Chain Reaction (PCR) 5 , inverse PCR 6 en Lineaire Amplification-Gemedieerde (LAM) PCR 7 , zijn het meest gebruikt. Het gebruik van plaatsspecifieke restrictie-enzymen genereert echter een voorspanning tijdens het ophalen van de IS, waardoor slechts een subset van integrogen (een vreemd DNA geïntegreerd in het gastheergenoom) in de nabijheid van de te herstellen restrictieplaats 4 wordt verkregen. Analyse technologieën die vector IS meer grondig beoordelen zijn ook in de afgelopen jaren geïntroduceerd. Deze assays gebruiken verschillende strategieën, waaronder Mu transposon-gemedieerde PCR 8 , nonrestrictive (nr) -LAM PCR 9 , type II-restrictie-enzym-mBewerkte spijsvertering 10 , mechanische afscheiding 11 en willekeurige hexamer-gebaseerde PCR (Re-free PCR) 12 , om genomische DNA's te fragmenteren en IS te amplificeren. Huidige technologieën hebben verschillende niveaus van detectiegevoeligheid, genoomdekking, doelspecifieke eigenschappen, hoge doorstroomcapaciteit, complexiteit van testprocedures en voorspellingen bij het detecteren van de relatieve frequenties van doelwitplaatsen. Gezien de verschillende kwaliteiten van de bestaande analyses en de verschillende doeleinden waarvoor ze kunnen worden gebruikt, moet de optimale assayaanpak nauwkeurig worden geselecteerd.
Dit werk bevat gedetailleerde experimentele procedures en een computergegevensanalyse-workflow voor een bidirectionele analyse die de detectiesnelheden en sequentiekwantificatierugtheden aanzienlijk verbetert door tegelijkertijd de IS stroomopwaarts en stroomafwaarts van het geïntegreerde doel DNA te analyseren (zie Figuur 1 voor een schematische weergave van de analyseprocedures ). Deze aanpak biedt ookS zijn de middelen om het retrovirale integratieproces te karakteriseren (bijvoorbeeld de getrouwheid van de duplicatie van de doelplaats en variaties in de genomische sequenties van stroomopwaartse en stroomafwaartse invoegingen). Andere bidirectionele methoden zijn voornamelijk gebruikt voor het klonen en sequenties van beide uiteinden van het doel DNA 11 , 13 , 14 . Deze analyse is uitgebreid geoptimaliseerd voor de hoge doorvoer en reproduceerbare kwantificering van vectorgemarkeerde klonen, met behulp van de goed gevestigde LM-PCR-methode en berekeningsanalyse-mapping, en voor het kwantificeren van zowel stroomopwaartse als stroomafwaartse verbindingen. Biregionale analyse met het TaqαI- enzym heeft bewezen bruikbaar voor high-throughput clonale kwantificering in preklinische studies 2 , 15 van stamcellen gentherapie. Dit papier beschrijft een gewijzigde methode met een meer frequente snijder (RsaI / CviQI – motief: GTAC) die verdubbelt tHij kansen om integrogen te detecteren in vergelijking met een Taqal-gebaseerde assay . Gedetailleerde experimentele en data analyse procedures die GTAC motief enzymen gebruiken voor lentivirale (NL4.3 en zijn derivaten) en gamma-retrovirale (pMX vectoren) vector IS analyse worden beschreven. De in de assay gebruikte oligonucleotiden zijn vermeld in Tabel 1 . In het aanvullende document wordt een intern scriptie script voor IS sequentie analyse gegeven.
Protocol
Representative Results
Discussion
De bidirectionele assay maakt het mogelijk simultaan te analyseren van zowel de stroomopwaartse (links) en downstream (rechts) vector-gastheer-DNA-verbindingssequenties en is bruikbaar in een aantal gentherapie-, stamcel- en kankeronderzoeksoepassingen. Het gebruik van GTAC-motiefenzymes (RsaI en CviQI) en de bidirectionele PCR-aanpak verbetert de kansen om een integraal (of een klonale populatie) te detecteren in vergelijking met eerdere TCGA- motiefenzym ( TaqaI ) gebaseerde assays <su…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Financiering werd verstrekt door de National Institutes of Health Grants R00-HL116234, U19 AI117941 en R56 HL126544; De National Science Foundation Grant DMS-1516675; De Nationale Onderzoeksstichting van Korea (NRF-2011-0030049, NRF-2014M3C9A3064552); En het KRIBB initiatief programma.
Materials
| Thermostable DNA polymerase | Agilent | 600424 | PicoMaxx Polymerase |
| Thermostable DNA polymerase buffer | Agilent | 600424 | PicoMaxx Polymerase buffer |
| Deoxynucleotide (dNTP) solution mix | New England Biolabs | N0447L | dNTP solution mix (10mM each) |
| PCR tubes | VWR International | 53509-304 | PCR Strip Tubes With Individual Attached Caps |
| 2ml microcentrifuge tube | Molecular Bioproducts | 3453 | microcentrifuge tubes |
| PCR purification kit | Qiagen | 28106 | |
| RsaI | New England Biolabs | R0167L | restriction enzyme |
| CviQI | New England Biolabs | R0639L | restriction enzyme |
| Buffer A | New England Biolabs | B7204S | NEB CutSmart buffer |
| DNA Polymerase I large (klenow) fragment | New England Biolabs | M0210L | Blunting |
| streptavidin beads solution | Invitrogen | 60101 | Dynabeads kilobaseBINDER kit |
| Binding Solution | Invitrogen | 60101 | Dynabeads kilobaseBINDER kit |
| Washing Solution | Invitrogen | 60101 | Dynabeads kilobaseBINDER kit |
| magnetic stand | ThermoFisher | 12321D | DynaMag™-2 Magnet |
| T4 DNA ligase | New England Biolabs | M0202L | T4 DNA ligase |
| 10X T4 DNA ligase buffer | New England Biolabs | B0202S | T4 DNA ligase reaction buffer |
| 5X T4 DNA ligase buffer | Invitrogen | 46300-018 | T4 DNA ligase buffer with polyethylene glycol-8000 |
| UV-Vis spectrophotometer | Fisher Scientific | S06497 | Nanodrop 2000 |
| pvuII | new England Biolabs | R0151L | restriction enzyme |
| sfoI | new England Biolabs | R0606L | restriction enzyme |
| Buffer B | new England Biolabs | B7203S | NEB buffer 3.1 |
| Nuclease free water | Integrated DNA Technologies | 11-05-01-14 | |
| Capillary electrophoresis | Qiagen | 9001941 | QIAxcel capillary electrophoresis |
| Veriti 96-well Fast Thermal Cycler | Thermo Fisher Scientific | 4375305 | PCR Instrument |
| Rotating wheel (or Roller) | Eppendorf | M10534004 | Cell Culture Roller Drums |
| DNA size marker | Qiagen | 929559 | QX size marker (100-2,500 bp) |
| DNA size marker | Qiagen | 929554 | QX size marker (50-1,500 bp) |
| DNA alignment markers | Qiagen | 929524 | QX DNA Alignment Marker |
| genomc DNA | Not Available | Not Available | Sample genomc DNA from in vivo or in vitro experiments |
References
- Serrao, E., Engelman, A. N. Sites of Retroviral DNA Integration: From Basic Research to Clinical Applications. Crit. Rev. Biochem. Mol. Bio. 51 (1), 26-42 (2016).
- Kim, S., et al. Dynamics of HSPC Repopulation in Nonhuman Primates Revealed by a Decade-Long Clonal-Tracking Study. Cell Stem Cell. 14 (4), 473-485 (2014).
- Bushman, F. Retroviral integration and human gene therapy. J. Clin. Invest. 117 (8), 2083-2086 (2007).
- Bystrykh, L. V., Verovskaya, E., Zwart, E., Broekhuis, M., de Haan, G. Counting stem cells: methodological constraints. Nat Meth. 9 (6), 567-574 (2012).
- Schröder, A., et al. HIV-1 integration in the human genome favors active genes and local hotspots. Cell. 110 (4), 521-529 (2002).
- Silver, J., Keerikatte, V. Novel use of polymerase chain reaction to amplify cellular DNA adjacent to an integrated provirus. J. Virol. 64, 3150 (1990).
- Schmidt, M., et al. High-resolution insertion-site analysis by linear amplification-mediated PCR (LAM-PCR). Nat. Meth. 4 (12), 1051-1057 (2007).
- Brady, T., et al. A method to sequence and quantify DNA integration for monitoring outcome in gene therapy. Nucleic Acids Res. 39 (11), e72 (2011).
- Gabriel, R., et al. Comprehensive genomic access to vector integration in clinical gene therapy. Nat. Med. 15 (12), 1431-1436 (2009).
- Kim, S., Kim, Y., Liang, T., Sinsheimer, J., Chow, S. A high-throughput method for cloning and sequencing human immunodeficiency virus type 1 integration sites. J. Virol. 80 (22), 11313-11321 (2006).
- Maldarelli, F., et al. Specific HIV integration sites are linked to clonal expansion and persistence of infected cells. Science. 345 (6193), 179-183 (2014).
- Wu, C., et al. High Efficiency Restriction Enzyme-Free Linear Amplification-Mediated Polymerase Chain Reaction Approach for Tracking Lentiviral Integration Sites Does Not Abrogate Retrieval Bias. Hum. Gene. Ther. 24 (1), 38-47 (2013).
- Aker, M., Tubb, J., Miller, D. G., Stamatoyannopoulos, G., Emery, D. W. Integration Bias of Gammaretrovirus Vectors following Transduction and Growth of Primary Mouse Hematopoietic Progenitor Cells with and without Selection. Mol. Ther. 14 (2), 226-235 (2006).
- Gabriel, R., Kutschera, I., Bartholomae, C. C., von Kalle, C., Schmidt, M. Linear Amplification Mediated PCR; Localization of Genetic Elements and Characterization of Unknown Flanking DNA. J Vis Exp. (88), e51543 (2014).
- Kim, S., et al. High-throughput, sensitive quantification of repopulating hematopoietic stem cell clones. J. Virol. 84 (22), 11771-11780 (2010).
- Mitchell, R., et al. Retroviral DNA integration: ASLV, HIV, and MLV show distinct target site preferences. PLoS Biol. 2 (8), e234 (2004).
- Melkus, M., et al. Humanized mice mount specific adaptive and innate immune responses to EBV and TSST-1. Nat. Med. 12 (11), 1316-1322 (2006).
- Bystrykh, L. V. A combinatorial approach to the restriction of a mouse genome. BMC Res Notes. 6, 284 (2013).
- Beard, B. C., Adair, J. E., Trobridge, G. D., Kiem, H. -. P. High-throughput genomic mapping of vector integration sites in gene therapy studies. Methods Mol Biol. , 321-344 (2014).
- Gabriel, R., et al. Comprehensive genomic access to vector integration in clinical gene therapy. Nat. Med. 15 (12), 1431-1436 (2009).
- Qin, X., An, D., Chen, I., Baltimore, D. Inhibiting HIV-1 infection in human T cells by lentiviral-mediated delivery of small interfering RNA against CCR5. Proc Natl Acad Sci U S A. 100 (1), 183-188 (2003).
- Kitamura, T., et al. Retrovirus-mediated gene transfer and expression cloning: powerful tools in functional genomics. Exp. Hematol. 31 (11), 1007-1014 (2003).
- Cartier, N., et al. Hematopoietic stem cell gene therapy with a lentiviral vector in X-linked adrenoleukodystrophy. Science. 326 (5954), 818-823 (2009).
