Uso de inmunomarcación para analizar microtúbulos estables, dinámicos y emergente en el embrión de pez cebra

Los microtúbulos (MTs) son polímeros de α – y β-tubulina que montar en protofilaments lineal, varios de los cuales se combinan para formar un tubo hueco^1,2. MTs son estructuras polarizadas, con rápido crecimiento más extremos y de crecimiento lento menos extremos que están anclados en el centrosoma o de organización de microtúbulos centro (MTOC)³. De novo Formación de MT es iniciada por nucleación en el complejo de anillo de γ-tubulina (γ-TURC), que proporciona una plantilla para montaje MT⁴. En cualquier célula dada, dos poblaciones de MTs se pueden distinguir a su vez sobre a diferentes velocidades. Dinámicas MTs exploran su entorno celular por la conmutación entre las fases de crecimiento y contracción en un proceso conocido como inestabilidad dinámica⁵. A diferencia de dinámicas MTs, MTs estables son adultos y tienen una vida media más larga que la dinámica de MTs⁶.

Décadas de investigación en biología celular ha proporcionado un conjunto sofisticado de herramientas para el estudio de la función y la estructura de MT y dio lugar a un gran cuerpo de conocimiento sobre estos elementos citoesqueléticos. Por ejemplo, MTs juegan un papel central en el establecimiento y mantenimiento de la polaridad celular, que es atribuible no sólo a su polaridad intrínseca, sino también a la distribución subcelular diferencial estable versus dinámica MTs^{7, 8}. en cambio, mucho menos se entiende sobre MT arquitectura y función en entornos más complejos tridimensionales (3D), como el embrión de vertebrados, en parte debido al desafío de citoesqueleto MT en alta resolución de imagen. A pesar de esta limitación, la reciente generación de transgénico GFP-expresando las líneas eso etiqueta MTs o expresión transitoria de fluorescencia etiquetada MT marcadores ha aumentado nuestra comprensión de los cambios dinámicos que MTs y su celular y papel del desarrollo en el embrión de pez cebra. Toda la red de MT puede ser reflejada en líneas transgénicas en que tubulina es directamente etiquetados polímeros⁹ o tubulina indirectamente están etiquetados con las proteínas asociadas a MT Doublecortin como cinasa (Dclk) o Ensconsin (EMTB)^{10, 11}. Se han generado otras líneas (y construcciones) que permiten una evaluación de polaridad intrínseca MT al etiquetado específicamente MT más extremos o centrosoma anclado menos extremos^{11,12,13, 14}. el poder de estas herramientas reside en la capacidad para estudiar la dinámica de la MT en vivo, desarrollo de organismos. Estos estudios han puesto de manifiesto, por ejemplo, la distribución espacial y dinámica de MTs en poblaciones celulares específicas, la orientación de mitotic husos en tejidos sometidos a morfogénesis (un indicador del plano de división celular), la polaridad del polímero MT lo que se refiere a procesos tales como la elongación celular y la migración y tasa de crecimiento de MT determinada por cometa velocidad^9,13,15. La limitación de estas herramientas es que ellos no fácilmente discriminar entre poblaciones de MT estables y dinámicas.

A partir de la literatura de biología celular rico, inmunomarcación imagen de MTs estables y dinámicos en el embrión del pez cebra se describen los métodos, que son complementarios al uso de líneas transgénicas. El uso generalizado de tales métodos de inmunomarcación en el pez cebra ha sido un poco obstaculizado por la dificultad de preservar la integridad de MT durante el procedimiento de fijación. 1 Protocolo describe un método optimizado para inmunomarcación total, dinámica, y estables MTs en las secciones del cerebelo en desarrollo del pez cebra. Además, un método sencillo usando comercialmente el software disponible se describe para cuantificar las poblaciones de MT. Estables MTs se distinguen de MTs dinámicos basados en varias modificaciones poste-de translación de la α-tubulina, como la acetilación y detyrosination, que se acumulan de MTs estables largo tiempo^16,17. En el embrión de pez cebra, la acetilación se produce MTs ciliares y axonales pero no estable interfase MTs¹⁸, limitando la utilidad de este marcador a un subconjunto de estabilizado MTs. En cambio, detyrosination parece ocurrir sobre todo estables MTs en el embrión de pez cebra¹⁸. Esta modificación poste-de translación expone el ácido glutámico de carboxi-terminal de α-tubulina (tubulina detyrosinated)¹⁸ y puede ser detectada utilizando anti-Glu-tubulina¹⁹. Aunque detyrosination se produce preferentemente en MTs estables, la evidencia experimental indica que esta modificación poste-de translación es el resultado de, en lugar de una causa de estabilidad MT¹⁶. Se distingue la población MT recíproca, compuesto por dinámicos MTs, usando un anticuerpo, anti-Tyr-tubulina, que reconoce específicamente la forma de tyrosinated de α-tubulina¹⁹. Después de inmunomarcación con estos marcadores y la proyección de imagen confocal, el análisis cuantitativo de MTs (longitud, número y abundancia relativa) puede realizarse en regiones definidas del tubo neural en desarrollo. Para realizar este análisis utilizando software de procesamiento de imágenes 3D se facilita un método racionalizado. Este método puede ser aplicado para resolver las preguntas con respecto a la morfogénesis y el establecimiento o la maduración de la célula polaridad²⁰. De hecho, la elaboración de matrices polarizados de MTs estables acompaña a muchos eventos del desarrollo, incluyendo fotorreceptor morfogénesis²¹, epitelización de las células en el desarrollo neural tubo¹⁸ y axón formación⁸.

Protocolo n ° 2 describe una adaptación en vivo de un ensayo de Biología de la célula para analizar MTs durante su Asamblea fase (nucleación/anclaje y crecimiento)^22,23. Nacientes MTs están nucleadas en el centrosoma y posteriormente ancladas a subdistal apéndices del centriolo madre²³. Se describe un método para analizar el incipiente rebrote MT después de despolimerización. Este protocolo proporciona detalles sobre el tratamiento del nocodazole a despolimerizar MTs, el procedimiento de lavado de la droga y el período de recuperación después del tratamiento. MT re-crecimiento se controla a intervalos regulareslavado de post s por inmunomarcación con marcadores para MTs totales (anti β-tubulina) junto con marcadores para el centrosoma (anti γ-tubulina) y núcleo (4′, 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI)), según los procedimientos generales descritos en el Protocolo 1. El paso de la despolimerización de MT de este protocolo es esencial ya que permite la evaluación del crecimiento de MT de novo en lugar de extensión de MTs preexistentes. Esta técnica es por lo tanto distinta de los otros procedimientos publicados para medir las tasas de crecimiento de MT (en ausencia de despolimerización) mediante el uso de un marcador de punta más como fin vinculante proteínas 3 fusionado a la proteína verde fluorescente (EB3-GFP), como se muestra en Tran et al., 2012¹¹. Además, este análisis es particularmente útil para el análisis de embriones defectuosos en Asamblea de novo MT, como los mutantes previamente divulgados de NEDD1 en el que se deteriora el reclutamiento de γ-tubulina en el centrosoma, dando por resultado incompleto formación del tubo neural y defectos neuronales²⁴.