Utilisation d’immunomarquage pour analyser des Microtubules stables et dynamiques naissants dans l’embryon de poisson zèbre

Les microtubules (MTs) sont des polymères de α – et β-tubuline qui s’assemble en protofilaments linéaire, dont plusieurs se combinent pour former un tube creux^1,2. MTs sont des structures polarisées, avec l’essor de plus fins et croissance lente moins les extrémités qui sont ancrées à centrosome ou autres organisation des microtubules center (MTOC)³. De novo Formation de MT est initiée par nucléation à l’anneau γ-tubuline complexe (γ-TURC), qui fournit un modèle pour les MT Assemblée⁴. Dans une cellule donnée, deux populations de MTs se distinguées ce tour-ci au fil à des vitesses différentes. Dynamiques MTs explorent leur environnement cellulaire par la commutation entre les phases de croissance et de rétrécissement dans un processus appelé instabilité dynamique⁵. Contrairement aux MTs dynamiques, stables MTs sont non productrices et ont une demi-vie plus longue que la dynamique MTs⁶.

Des décennies de recherche en biologie cellulaire a fourni une sophistiqué panoplie d’outils pour étudier la fonction et la structure de la MT et a donné lieu à un vaste corpus de connaissances sur ces éléments du cytosquelette. Par exemple, MTs jouent un rôle central dans l’établissement et le maintien de la polarité cellulaire, qui est attribuable non seulement à leur polarité intrinsèque, mais aussi à la distribution subcellulaire différentielle des stable versus dynamique MTs^{7, 8}. en revanche, beaucoup moins est entendu sur l’architecture de MT et de fonctionner dans des environnements de (3-d) en trois dimensions plus complexes, tels que les embryons de vertébrés, en partie en raison de relever le défi de l’imagerie du cytosquelette MT à haute résolution. Malgré cette limitation, la récente génération de GFP-transgénique exprimant les lignes que MTs de l’étiquette ou une expression transitoire de marqueurs de MT fluorescent-étiquetées a augmenté notre compréhension des changements dynamiques qui subissent une MTs et leur cellulaire et rôle de développement de l’embryon de poisson zèbre. L’ensemble du réseau MT peut être photographié sur des lignées transgéniques dans laquelle tubuline est soit directement marqué⁹ ou tubuline polymères sont indirectement étiquetés à l’aide de protéines associées à la MT Doublecortin-like-kinase (Dclk) ou Ensconsin (EMTB)^{10, 11}. Autres lignes (et constructions) ont été générées qui permet d’évaluer des polarité intrinsèque MT par marquage spécifiquement MT plus fins ou ancrées à un centrosome moins les extrémités^{11,12,13, 14}. la puissance de ces outils réside dans la possibilité d’étudier la dynamique de la MT en direct, les organismes de développement. Ces études ont révélé, par exemple, la distribution spatiale et dynamique de MTs dans les populations de cellules spécifiques, l’orientation du mitotique broches en tissus subissant la morphogenèse (indicateur du plan de division cellulaire), la polarité du polymère MT en ce qui concerne les processus tels que l’élongation cellulaire et de la migration et les taux de croissance MT déterminé par comète vitesse^9,13,15. La limitation de ces outils est qu’ils ne sont pas facilement discriminatoires entre les populations stables et dynamiques de MT.

Puisant dans la littérature de biologie cellulaire riche, méthodes d’immunomarquage à l’image des MTs stables et dynamiques dans l’embryon de poisson zèbre sont décrites ici, qui sont complémentaires à l’usage des lignées transgéniques. La généralisation de ces méthodes d’immunomarquage dans le poisson-zèbre a été quelque peu gênée par la difficulté à préserver l’intégrité de la MT au cours de la procédure de fixation. 1 Protocole décrit une méthode optimisée d’immunomarquage total, dynamique, et MTs stables dans les sections du développement postérieur de poisson-zèbre efficaces. En outre, une méthode simple utilisant commercialement logiciels disponibles sont décrite afin de quantifier ces populations de MT. MTs stables sont distinguent des MTs dynamiques basés sur plusieurs modifications post-traductionnelles de α-tubuline, tels que l’acétylation et détyrosination, qui s’accumulent sur les MTs stables au fil du temps^16,17. Chez l’embryon de poisson zèbre, acétylation apparaît au MTs ciliaires et axonales alors pas stable interphase MTs¹⁸, limiter l’utilité de ce marqueur à un sous-ensemble de MTs stabilisées. En revanche, détyrosination semble se produire sur toutes les MTs stables dans l’ embryon de poisson zèbre¹⁸. Cette modification post-traductionnelle expose l’acide glutamique carboxy-terminale de le α-tubuline (tubuline détyrosinée)¹⁸ et peut être détectée à l’aide d’anti-Glu-tubuline¹⁹. Bien que détyrosination se produit préférentiellement sur MTs stables, des preuves expérimentales indiquent que cette modification post-traductionnelle est un résultat de, plutôt qu’une cause de, MT stabilité¹⁶. La population de MT réciproque, composée de MTs dynamiques, se distingue à l’aide d’un anticorps, anti-Tyr-tubuline, qui reconnaît spécifiquement la forme tyrosinée de tubuline α¹⁹. Après l’immunomarquage avec ces marqueurs et imagerie confocale, l’analyse quantitative des MTs (longueur, nombre et abondance relative) est possible dans des régions définies du tube neural en voie de développement. Une méthode simplifiée est fournie ici pour réaliser cette analyse à l’aide de logiciels de traitement d’images 3D. Cette méthode peut être appliquée pour répondre aux questions au sujet de la morphogénèse et la création ou la maturation des cellules polarité²⁰. En effet, l’élaboration de tableaux polarisées de MTs stables accompagne de nombreuses manifestations du développement, y compris les photorécepteurs morphogenèse²¹, épithélialisation des cellules dans le développement du tube neural¹⁸ et axon formation⁸.

Protocole n° 2 décrit une adaptation in vivo d’une épreuve de biologie cellulaire pour analyser des MTs au cours de leur Assemblée phase (/ l’ancrage de la nucléation et croissance)^22,23. Naissantes MTs sont nucléés à centrosome et par la suite fixés au subdistal appendices de la mère centriole²³. On décrit une méthode pour analyser naissant MT repousse après la dépolymérisation. Ce protocole fournit des détails sur le traitement de la nocodazole pour dépolymériser MTs, la procédure de lavage des drogues et la période de récupération après le traitement. MT repousse est contrôlée à intervalles régulierslavage post s par immunomarquage avec des marqueurs pour MTs totales (anti-β-tubuline) aux côtés de marqueurs pour le centrosome (anti-γ-tubuline) et noyau (4′, 6-diamidino-2-phénylindole (DAPI)), selon les procédures décrites dans le protocole 1. L’étape de dépolymérisation MT du présent protocole est essentielle car elle permet d’évaluation de la croissance de MT de novo plutôt qu’extension de MTs préexistants. Cette technique est donc distincte des autres procédures publiées pour mesurer les taux de croissance de MT (en absence de dépolymérisation) à l’aide d’un marqueur plus comme l’ailier liaison protéine 3 fondue à la protéine fluorescente verte (GFP-EB3), comme illustré dans la Tran et al., ¹¹de 2012. En outre, ce test est particulièrement utile pour analyser les embryons défectueux en Assemblée de novo MT, tels que les mutants de NEDD1 rapportées antérieurement, dans lequel le recrutement de la γ-tubuline à centrosome est entravé, ayant pour résultat incomplet la formation du tube neural et défauts neuronale²⁴.