Verwendung von Immunolabeling, stabilen, dynamischen und im Entstehen begriffene Mikrotubuli in Zebrafish Embryos zu analysieren

Mikrotubuli (MTs) sind Polymere von α und β-Tubulin, die in linearen Protofilaments zusammenbauen, von denen mehrere kombinieren, um eine hohle Röhre^1,2bilden. MTs sind polarisierte Strukturen, mit schnell wachsenden plus enden und minus enden, die an die Centrosome oder andere Mikrotubuli-organizing Center (MTOC)³verankert sind langsamwüchsig. De novo MT-Bildung wird durch Keimbildung bei der γ-Tubulin-Ring-Komplex (γ-TURC), bietet eine Vorlage für MT Montage⁴eingeleitet. In einer bestimmten Zelle können zwei Populationen von MTs, die wiederum über unterschiedlich unterschieden werden. Dynamische MTs erforschen ihre zelluläre Umgebung durch den Wechsel zwischen Phasen von Wachstum und Schrumpfung in einem Prozeß bekannt als dynamische Instabilität⁵. Im Gegensatz zu dynamischen MTs stabile MTs nicht wachsen und haben eine längere Halbwertszeit als dynamische MTs⁶.

Jahrzehntelanger Forschung in Zellbiologie hat eine anspruchsvolle Reihe von Tools zur Untersuchung MT Struktur und Funktion zur Verfügung gestellt und führte zu einen großen Körper des Wissens über diese Zellskelett Elemente. Zum Beispiel MTs spielen eine zentrale Rolle bei der Einrichtung und Wartung der Zellpolarität, die nicht nur auf ihre innere Polarität, sondern auch für die differenzielle subzelluläre Verteilung der Stall im Vergleich zu dynamischen MTs^7, ist ⁸. dagegen weit weniger versteht sich über MT Architektur und Funktion in komplexere dreidimensionale (3D) Umgebungen, z. B. vertebrate Embryos, teilweise wegen der Herausforderung von imaging-MT Zytoskeletts mit hoher Auflösung. Trotz dieser Einschränkung die jüngsten Generation der GFP exprimierenden transgene Linien dieses Label MTs oder transiente Expression fluoreszent markiert MT Marker erhöht hat unser Verständnis von der dynamischen Veränderungen, die MTs zu unterziehen und ihre zellulären und Rolle des Zebrafish Embryos. Das Gesamtnetz der MT kann abgebildet in transgenen Linien in die Tubulin ist entweder direkt beschriftet⁹ oder Tubulin Polymere mit MT-assoziierte Proteine indirekt gekennzeichnet sind Doublecortin-Like-Kinase (Dclk) oder Ensconsin (EMTB)^{10, 11}. Andere Linien (und Konstrukte) erzeugt wurden, die Bewertung der MT innere Polarität durch gezielt beschriften MT plus enden aktivieren oder Centrosome verankert minus enden^{11,12,13, 14}. die Macht dieser Werkzeuge liegt in der Fähigkeit, MT Dynamik im Leben, zu studieren Organismen zu entwickeln. Solche Studien haben gezeigt, zum Beispiel die räumliche und dynamische Verteilung der MTs in bestimmten Zellpopulationen, die Ausrichtung der mitotischen Spindeln im Gewebe Morphogenese (ein Indikator für die Ebene der Zellteilung), durchläuft die Polarität des MT-Polymers Bezug auf Prozesse wie Zelle Dehnung und Migration, und MT Wachstumsrate von Komet Geschwindigkeit^9,13,15bestimmt. Die Begrenzung dieser Werkzeuge ist, dass sie nicht ohne weiteres zwischen stabiler und dynamischer MT Bevölkerungsgruppen diskriminieren.

Zeichnung aus der reichen Zelle Biologie Literatur, werden Immunolabeling Methoden, um stabile und dynamische MTs des Zebrafish Embryos Bild hier beschrieben, sind die Verwendung von transgenen Linien ergänzen. Der weit verbreiteten Einsatz solcher Immunolabeling Methoden in der Zebrabärbling wurde durch die Schwierigkeit MT Integrität zu bewahren, während des Verfahrens Fixierung etwas behindert. Protokoll Nr. 1 beschreibt eine optimierte Methode für Immunolabeling insgesamt, dynamisch, und stabile MTs in Querschnitte der entwickelnden Zebrafisches Hinterhirn. Darüber hinaus ist eine einfache Methode, die Verwendung von kommerziell verfügbaren Software beschrieben, um diese MT-Populationen zu quantifizieren. Stabile MTs unterscheiden sich von dynamischen MTs basierend auf mehrere post-translationalen Modifikationen von α-Tubulin, wie Acetylierung und Detyrosination, die auf stabile MTs über Zeit^16,17ansammeln. Im Zebrafish Embryos tritt Acetylierung auf ciliary und axonalen MTs aber nicht auf stabile Interphase MTs¹⁸, die Nützlichkeit dieses Markers auf eine Teilmenge der stabilisierten MTs zu begrenzen. Im Gegensatz dazu scheint Detyrosination auf allen stabilen MTs im Zebrafish Embryos¹⁸auftreten. Diese Post-translationale Modifikation stellt die Carboxy-Terminal Glutaminsäure α-Tubulin (Detyrosinated Tubulin)¹⁸ und mit Anti-Glu-Tubulin¹⁹detektiert werden. Obwohl Detyrosination bevorzugt auf stabile MTs auftritt, zeigt experimentelle Beweise, dass dieser Post-translationale Modifikation zurückzuführen, sondern als eine Ursache für MT Stabilität¹⁶. Die gegenseitige MT Bevölkerung, bestehend aus dynamischen MTs zeichnet sich mit einem Antikörper, anti-Tyr-Tubulin, erkennt, dass speziell die Tyrosinated Form von α-Tubulin¹⁹. Nach Immunolabeling mit diesen Markern und konfokale Bildgebung kann die Quantitative Analyse von MTs (Länge, Anzahl und relative Häufigkeit) in definierten Regionen des entwickelnden Neuralrohrs durchgeführt werden. Eine optimierte Methode ist hier für die Durchführung dieser Analyse mit 3-d-Bildverarbeitung Software zur Verfügung gestellt. Diese Methode kann auf Fragen bezüglich Morphogenese und der Einrichtung oder Reifung der Zelle Polarität²⁰angewendet werden. In der Tat, die Ausarbeitung von polarisierten Arrays von stabilen MTs begleitet viele entwicklungspolitische Veranstaltungen, darunter Photorezeptor Morphogenese²¹, Epithelisierung von Zellen in den Entwicklungsländern Neuralrohr¹⁸ und Axon Bildung⁸.

Protokoll Nr. 2 beschreibt eine in-Vivo -Adaption eines Zelle Biologie Assays MTs Analyse während ihrer Versammlung Phase (Keimbildung/Anchorage und Wachstum)^22,23. Im Entstehen begriffenen MTs sind kernhaltige an die Centrosome und anschließend an subdistal Anhängsel der Mutter Zentriol²³verankert. Eine Methode, um entstehende MT nachwachsen nach Depolymerisation analysieren wird beschrieben. Dieses Protokoll enthält Informationen über die Nocodazole Behandlung, MTs, das Medikament Auswaschung Verfahren und der Nachbehandlung Erholungsphase depolymerisieren. MT nachwachsen wird in regelmäßigen Abständen überwacht.s Post Auswaschung von Immunolabeling mit Markierungen für insgesamt MTs (anti-β-Tubulin) neben Marker für die Centrosome (anti-γ-Tubulin) und Kern (4′, 6-Diamidino-2-Phenylindole (DAPI)), nach den allgemeinen Verfahren, die im Protokoll Nr. 1beschrieben. Der MT Depolymerisation Schritt dieses Protokolls ist wichtig, da es ermöglicht die Beurteilung der de Novo MT Wachstum als Erweiterung der bereits vorhandenen MTs. Diese Technik unterscheidet sich somit von anderen veröffentlichten Verfahren, MT Wachstumsraten (in Abwesenheit der Depolymerisation) zu messen, durch die Verwendung einer plus Spitze Markers wie Ende bindende Protein 3 verschmolzen zu grün fluoreszierendes Protein (EB3-GFP), wie im Tran Et Al.gezeigt, 2012-¹¹. Darüber hinaus dieser Assay eignet sich besonders für die Analyse von Embryonen in de Novo MT Baugruppe defekt wie die zuvor gemeldeten NEDD1 Mutanten in der Rekrutierung von γ-Tubulin, das Centrosome beeinträchtigt ist, was zu unvollständig Bildung des Neuralrohrs und neuronale Defekte²⁴.