Uso de Immunolabeling para analisar os microtúbulos estáveis, dinâmicos e emergentes no embrião Zebrafish

Microtúbulos (MTs) são polímeros de α – e β-tubulina que reúne numa protofilamentos lineares, vários dos quais se combinam para formar um tubo oco^1,2. MTs são estruturas polarizadas, com rápido crescimento além de extremidades e crescimento lento menos extremidades ancorados na centrossoma ou outros microtubule-organização centro (MTOC)³. De novo Formação de MT é iniciada pela nucleação no complexo anel γ-tubulina (γ-TURC), que fornece um modelo para montagem de MT⁴. Em qualquer determinada célula, duas populações de MTs distinguem-se a curva sobre a taxas diferentes. MTs dinâmicos explorar seu ambiente celular alternando entre fases de crescimento e retração em um processo conhecido como instabilidade dinâmica⁵. Ao contrário de dinâmicas MTs, MTs estáveis são não-crescimento e tem uma meia-vida mais longa que a dinâmica MTs⁶.

Décadas de pesquisa em biologia celular tem fornecido um sofisticado conjunto de ferramentas para estudar a função e estrutura de MT e resultou em um grande corpo de conhecimento sobre esses elementos do citoesqueleto. Por exemplo, MTs desempenham um papel central no estabelecimento e na manutenção da polaridade da célula, que é atribuível não só a sua polaridade intrínseca, mas também para a distribuição diferencial subcellular de estábulo versus dinâmico MTs^{7, 8}. em contraste, muito menos é compreendido sobre arquitetura de MT e função em ambientes (3D) tridimensionais mais complexos, tais como os embriões vertebrados, em parte devido ao desafio de citoesqueleto MT em alta resolução de imagem. Apesar desta limitação, a geração recente de transgênico GFP-expressando as linhas esse rótulo MTs ou expressão transiente de marcadores de MT marcados fluorescentemente aumentou nossa compreensão das mudanças dinâmicas que se submetem a MTs e seus celulares e papel do desenvolvimento no embrião zebrafish. Toda a rede de MT pode ser fotografada em linhas transgénicas na qual tubulina ou é diretamente rotulados polímeros⁹ ou tubulina indiretamente são etiquetados usando proteínas associadas MT Doublecortin-como-quinase (Dclk) ou Ensconsin (EMTB)^{10, 11}. Outras linhas (e construções) foram geradas que permitem avaliação de polaridade intrínseca de MT por rotulagem especificamente MT além termina ou centrossoma ancorada menos termina^{11,12,13, 14}. o poder dessas ferramentas encontra-se na capacidade de estudar a dinâmica de MT em ao vivo, organismos em desenvolvimento. Tais estudos têm revelado, por exemplo, a distribuição espacial e dinâmica de MTs em populações de células específicas, a orientação de mitótica fusos em tecidos submetidos a morfogênese (um indicador do plano de divisão celular), a polaridade do polímero MT no que se refere aos processos, tais como alongamento celular e migração e a taxa de crescimento de MT determinada pelo cometa velocidade^9,13,15. A limitação dessas ferramentas é que eles não prontamente qualquer discriminação entre as populações de MT estáveis e dinâmicas.

Desenho da literatura biologia celular rico, immunolabeling métodos de imagem estáveis e dinâmicos MTs no zebrafish embrião são descritos aqui, que são complementares para o uso de linhas transgénicas. O uso generalizado de tais métodos immunolabeling no zebrafish tem sido um pouco dificultado pela dificuldade em preservar a integridade de MT durante o procedimento de fixação. 1 protocolo descreve um método otimizado para immunolabeling total, dinâmico, e MTs estáveis em secções do rombencéfalo zebrafish desenvolvimento transversais. Além disso, um método simples usando comercialmente software disponível é descrita para quantificar estas populações de MT. MTs estáveis são distintos dos MTs dinâmicos com base em várias modificações borne-translational do α-tubulina, tais como a acetilação e detyrosination, que se acumulam na MTs estáveis ao longo do tempo^16,17. No embrião zebrafish, acetilação ocorre em ciliares e axonal MTs mas não em interfase estável MTs¹⁸, limitando a utilidade deste marcador a um subconjunto de MTs estabilizados. Em contraste, detyrosination parece ocorrer em todos os MTs estáveis em zebrafish embrião¹⁸. Esta modificação pós-traducional expõe o ácido glutâmico carboxy-terminal de α-tubulina (detyrosinated tubulina)¹⁸ e pode ser detectada usando anti-Glu-tubulina¹⁹. Embora detyrosination ocorre preferencialmente na MTs estáveis, evidência experimental indica que esta modificação pós-traducional é um resultado de, ao invés de uma causa de, estabilidade de MT¹⁶. Distingue-se a população MT recíproca, composta por MTs dinâmicos, usando um anticorpo, anti-Tyr-tubulina, que reconhece especificamente a forma tyrosinated de α-tubulina¹⁹. Após immunolabeling com estes marcadores e imagem latente confocal, análise quantitativa de MTs (comprimento, número e abundância relativa) pode ser realizada em regiões definidas do tubo neural em desenvolvimento. Aqui, é fornecido um método simplificado para realizar esta análise, utilizando o software de processamento de imagem em 3D. Esse método pode ser aplicado para responder a perguntas sobre morfogênese e o estabelecimento ou a maturação de células polaridade²⁰. Com efeito, a elaboração de matrizes polarizadas de estáveis MTs acompanha muitos eventos do desenvolvimento, incluindo fotorreceptoras morfogênese²¹, epitelização das células no desenvolvimento do tubo neural¹⁸ e axônio formação⁸.

2 protocolo descreve uma adaptação na vivo de um ensaio de biologia de pilha para analisar MTs durante sua montagem fase (nucleação/fixação e crescimento)^22,23. MTs nascentes são nucleated na centrossoma e posteriormente ancoradas apêndices subdistal da mãe centriole²³. É descrito um método para analisar a nascente MT rebrota após despolimerização. Este protocolo fornece detalhes sobre o tratamento de nocodazole para depolymerize MTs, o processo de esmaecimento de droga e o período de recuperação pós-tratamento. Re-crescimento de MT é monitorado em intervalos regularesesmaecimento de post s por immunolabeling com marcadores para MTs totais (anti β-tubulina) ao lado de marcadores para a centrossoma (anti γ-tubulina) e núcleo (4′, 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI)), de acordo com os procedimentos gerais descritos no protocolo 1. A etapa de despolimerização MT do presente protocolo é essencial, como permite a avaliação do crescimento de MT de novo , em vez de extensão de MTs preexistentes. Esta técnica é, portanto, distinta de outros procedimentos publicados para medir as taxas de crescimento de MT (na ausência de despolimerização) usando um marcador de ponta mais como fim proteína 3 fundido a proteína verde fluorescente (EB3-GFP), conforme mostrado no Tran et al., 2012¹¹. Além disso, este ensaio é particularmente útil para a análise de embriões com defeito na montagem de novo MT, tais como os mutantes NEDD1 relatados anteriormente, em que o recrutamento de γ-tubulina para a centrossoma é prejudicado, resultando em incompleta formação do tubo neural e defeitos neuronal²⁴.