Uso di Immunolabeling per analizzare i microtubuli stabili, dinamici e nascenti nell'embrione di pesce zebra

Microtubuli (MTs) sono polimeri di α – e β-tubulina che assemblare in protofilamenti lineari, molte delle quali si combinano per formare un tubo cavo^1,2. Le MT sono strutture polarizzate, con rapida crescita plus estremità ed a crescita lenta meno le estremità che sono ancorate al centrosoma o altri di organizzazione dei microtubuli (MTOC) centro³. De novo Formazione di MT è iniziata da nucleazione presso l’anello di γ-tubulina complessa (γ-TURC), che fornisce un modello per MT montaggio⁴. In ogni cellula, due popolazioni di MTs possono essere distinte che girano sopra ai tassi differenti. MTs dinamico esplorare il loro ambiente cellulare passando tra le diverse fasi di crescita e di ritiro in un processo noto come instabilità dinamica⁵. A differenza di dinamica MTs, MTs stabile sono non-crescita e hanno un’emivita più lunga rispetto a dinamiche MTs⁶.

Decenni di ricerca in biologia cellulare ha fornito una sofisticata gamma di strumenti per studiare la funzione e la struttura MT e ha provocato un grande corpo di conoscenza su questi elementi del citoscheletro. Per esempio, MTs gioca un ruolo centrale nella creazione e mantenimento della polarità cellulare, che è attribuibile non solo alla loro polarità intrinseca, ma anche per la distribuzione subcellulare differenziale della scuderia contro dinamico MTs^{7, 8}. al contrario, molto meno è capito circa MT architettura e funzione in ambienti (3D) tridimensionale più complessi, come l’embrione dei vertebrati, in parte dovuto la sfida di imaging del citoscheletro MT ad alta risoluzione. Nonostante questa limitazione, la più recente generazione di transgenici esprimenti GFP linee quell’etichetta MTs o transitoria espressione di marcatori di MT fluorescente-Tag ha aumentato la nostra comprensione dei cambiamenti dinamici che MTs subiscono e loro cellulare e ruolo dello sviluppo nell’embrione di zebrafish. L’intera rete MT può essere imaged in linee transgeniche in cui tubulina è sia direttamente con etichetta⁹ o tubulina polimeri sono etichettati indirettamente utilizzando proteine associate MT Doublecortin-like-chinasi (Dclk) o Ensconsin (EMTB)^{10, 11}. Altre linee (e costrutti) sono stati generati che consentire la valutazione della polarità intrinseca MT identificando specificamente MT più finisce o ancorato centrosoma meno estremità^{11,12,13, 14}. la potenza di questi strumenti si trova nella capacità di studiare la dinamica di MT in diretta, lo sviluppo di organismi. Tali studi hanno rivelato, ad esempio, la distribuzione spaziale e dinamica di MTs in popolazioni di cellule specifiche, l’orientamento di mitotic mandrini in tessuti in fase di morfogenesi (un indicatore del piano di divisione delle cellule), la polarità del polimero MT per quanto riguarda processi quali allungamento delle cellule e la migrazione e tasso di crescita di MT determinata dalla cometa velocità^9,13,15. La limitazione di questi strumenti è che essi non prontamente discriminano tra popolazioni MT stabile e dinamici.

Attingendo alla letteratura biologia cellulare ricca, immunolabeling metodi di immagine stabile e dinamico MTs nell’embrione di zebrafish sono descritti qui, che sono complementari all’uso di linee transgeniche. L’uso molto diffuso di tali metodi immunolabeling in zebrafish è stata un po’ ostacolata dalla difficoltà nel preservare l’integrità MT durante la procedura di fissazione. 1 protocollo delinea un metodo ottimizzato per immunolabeling totale, dinamico, e stabile MTs in sezioni trasversali del hindbrain zebrafish in via di sviluppo. Inoltre, un metodo diretto utilizzando commercialmente disponibile software è descritto per quantificare queste popolazioni di MT. MTs stabile si distinguono da MTs dinamico basato su diverse modificazioni post-traduzionali di α-tubulina, quali acetilazione e detyrosination, che si accumulano su MTs stabile nel tempo^16,17. Nell’embrione di zebrafish, acetilazione si verifica su MTs ciliare e axonal ma non su stabile interfase MTs¹⁸, limitando l’utilità di questo indicatore a un sottoinsieme di MTs stabilizzato. Al contrario, detyrosination sembra verificarsi su tutte le MTs stabile nel quartiere di embrione di zebrafish¹⁸. Questa modificazione post-traduzionale espone l’acido glutammico carbossi-terminale di α-tubulina (detyrosinated tubulina)¹⁸ e può essere rilevata utilizzando anti-Glu-tubulina¹⁹. Anche se detyrosination si verifica preferenzialmente su MTs stabile, la prova sperimentale indica che questa modificazione post-traduzionale è un risultato di, piuttosto che una causa di, MT stabilità¹⁶. La popolazione di reciproco MT, composta da MTs dinamico, si distingue usando un anticorpo, anti-Tyr-tubulina, che riconosce specificamente la forma di termine di α-tubulina¹⁹. A seguito di immunolabeling con questi marcatori e imaging confocale, l’analisi quantitativa di MTs (lunghezza, numero e abbondanza relativa) può essere eseguita in regioni definite del tubo neurale in via di sviluppo. Qui vi attende un metodo semplificato per l’esecuzione di questa analisi utilizzando software di elaborazione delle immagini 3D. Questo metodo può essere applicato per rispondere alle domande per quanto riguarda la morfogenesi e l’istituzione o la maturazione delle cellule polarità²⁰. Infatti, l’elaborazione di matrici polarizzate di MTs stabile accompagna molti eventi inerenti allo sviluppo, tra cui fotorecettore morfogenesi²¹, epithelialization delle cellule nello sviluppo del tubo neurale¹⁸ e assone formazione⁸.

Protocollo n. 2 descrive un adattamento in vivo di un’analisi di biologia delle cellule per analizzare MTs durante il loro montaggio fase (nucleazione/anchorage e crescita)^22,23. Nascente MTs sono nucleate presso il centrosoma e successivamente ancorati alla subdistal appendici della madre Centriolo²³. È descritto un metodo per analizzare la nascente ricrescita MT seguendo la depolimerizzazione. Questo protocollo fornisce dettagli sul trattamento nocodazole a depolymerize MTs, la procedura di washout di droga e il periodo di recupero post-trattamento. MT. re-crescita viene monitorata ad intervalli regolariwashout post s da immunolabeling con marcatori per MTs totale (anti β-tubulina) al fianco di marcatori per il centrosoma (anti γ-tubulina) e nucleo (4′, 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI)), secondo le procedure generali descritte nel protocollo n. 1. Il passo di depolimerizzazione MT del presente protocollo è essenziale in quanto permette la valutazione della crescita MT de novo piuttosto che estensione di preesistenza MTs. Questa tecnica è quindi distinta da altre procedure pubblicate per misurare i tassi di crescita di MT (in assenza di depolimerizzazione) utilizzando un marcatore con punta plus come fine proteina 3 fusa alla proteina fluorescente verde (EB3-GFP), come mostrato in Tran et al., 2012¹¹. Inoltre, questo test è particolarmente utile per l’analisi di embrioni difettosi in de novo MT assieme, come ad esempio i mutanti NEDD1 precedentemente segnalati in cui il reclutamento di γ-tubulina per il centrosoma è alterato, conseguente incompleta formazione del tubo neurale e difetti di un neurone²⁴.