Gebruik van Immunolabeling voor het analyseren van ontluikende, stabiele en dynamische microtubuli in de zebravis Embryo

Microtubuli (MTs) zijn polymeren van α – en β-tubuline dat tot lineaire protofilaments samenvoegen, waarvan er verscheidene combineren om te vormen van een holle buis^1,2. MTs zijn gepolariseerde structuren, met snelgroeiende plus uiteinden en langzaam groeiende minus uiteinden die zijn verankerd in de centrosoom of andere microtubulus-organiseren center (MTOC)³. DOVO MT vorming wordt geïnitieerd door nucleatie op de complexe γ-tubuline-ring (γ-TURC), waarmee een sjabloon voor MT vergadering⁴. In een bepaalde cel kunnen twee populaties van MTs worden onderscheiden die draaien tegen verschillende tarieven. Dynamische MTs verkennen hun cellulaire omgeving door te schakelen tussen de fasen van groei en krimp in een proces dat bekend staat als dynamische instabiliteit⁵. In tegenstelling tot dynamische MTs, stabiele MTs zijn niet-groeiende en hebben een langere halfwaardetijd dan dynamische MTs⁶.

Decennia van onderzoek in de celbiologie heeft geboden een verfijnde allerlei tools om te studeren MT structuur en functie en resulteerde in een grote hoeveelheid kennis over deze cytoskeletal elementen. Bijvoorbeeld, MTs spelen een centrale rol bij de totstandbrenging en het onderhoud van de polariteit van de cel, die toe te schrijven niet alleen aan hun intrinsieke polariteit, maar ook voor de differentiële subcellular verdeling van stabiel versus dynamische MTs^7, is ⁸. daarentegen veel minder is begrepen over MT architectuur en functie in meer complexe driedimensionale (3-D) omgevingen, zoals het gewervelde embryo, gedeeltelijk als gevolg van de uitdaging van het cytoskelet van de MT op hoge resolutie beeldvormende. Niettegenstaande deze beperking, de recente generatie GFP-uiting te geven aan transgene lijnen dat label MTs of voorbijgaande expressie van fluorescently-tagged MT markers toegenomen ons begrip van de dynamische veranderingen die MTs ondergaan en hun cellulaire en Developmental rol in de zebravis embryo. Het hele MT-netwerk kan worden beeld in transgene lijnen in welke tubuline is ofwel rechtstreeks gelabelde⁹ of tubuline polymeren niet indirect worden aangeduid met behulp van MT-geassocieerde eiwitten Doublecortin-like-kinase (Dclk) of Ensconsin (EMTB)^{10, 11}. Andere lijnen (en constructies) zijn gegenereerd die beoordeling van MT intrinsieke polariteit inschakelen door specifiek labeling MT plus eindigt of centrosoom-verankerd minus uiteinden^{11,12,13, 14}. de kracht van deze tools ligt in de mogelijkheid te bestuderen van MT dynamiek in leven, ontwikkeling van organismen. Dergelijke studies is gebleken dat, bijvoorbeeld, de ruimtelijke en dynamische verdeling van MTs in specifieke cel populaties, de oriëntatie van de mitotische spindles in weefsels morfogenese (een indicator van het vliegtuig van celdeling), ondergaan de polariteit van het MT-polymeer met betrekking tot processen zoals cel rek en migratie, en MT groeitempo op jaarbasis bepaald door komeet snelheid^9,13,15. De beperking van deze tools is dat ze niet gemakkelijk tussen stabiele en dynamische MT populaties discrimineren.

Tekening uit de rijke cel biologie literatuur, worden immunolabeling methoden om het imago van stabiele en dynamische MTs in de zebravis embryo hier beschreven, die zijn een aanvulling op het gebruik van transgene lijnen. Het wijdverbreide gebruik van dergelijke methodes van de immunolabeling in de zebravis enigszins belemmerd door de moeilijkheid in het MT integriteit behouden tijdens de procedure fixatie. Protocol 1 schetst een geoptimaliseerde methode voor immunolabeling totaal, dynamische, en stabiele MTs in grensoverschrijdende secties van de ontwikkelingslanden zebrafish hindbrain. Bovendien, een eenvoudige methode met behulp van commercieel beschikbare software wordt beschreven om het kwantificeren van de populaties van deze MT. Stabiele MTs onderscheiden zich van dynamische MTs gebaseerd op verschillende posttranslationele modificaties van α-tubuline, zoals acetylation en detyrosination, die op stabiele MTs in de tijd^{16,17 accumuleren}. In het embryo van de zebravis, vindt acetylation plaats op Ciliaire en axonale MTs maar niet op stabiele interfase MTs¹⁸, beperking van het nut van deze markering tot een subset van gestabiliseerde MTs. Daarentegen lijkt detyrosination optreden op alle stabiele MTs in de zebravis embryo¹⁸. Deze posttranslationele wijziging blootstelt de glutaminezuur carboxy-terminal van α-tubuline (detyrosinated tubuline)¹⁸ en kan worden opgespoord met behulp van anti-Glu-tubuline¹⁹. Hoewel detyrosination bij voorkeur op stabiele MTs plaatsvindt, experimenteel bewijs geeft aan dat deze posttranslationele wijziging een gevolg van, in plaats van een doodsoorzaak, MT stabiliteit¹⁶. De wederzijdse MT bevolking, samengesteld uit dynamische MTs, onderscheidt zich met behulp van een antilichaam, anti-Tyr-tubuline, die specifiek de tyrosinated vorm van α-tubuline¹⁹herkent. Na immunolabeling met deze markeringen en confocal beeldvorming, de kwantitatieve analyse van MTs (lengte, aantal en relatieve overvloed) kan worden uitgevoerd in bepaalde regio’s van de ontwikkeling van de neurale buis. Een gestroomlijnde methode is hier geboden voor het uitvoeren van deze analyse met behulp van 3D-beeldverwerking software. Deze methode kan worden toegepast om vragen te stellen met betrekking tot voedselproductie en de inrichting of de rijping van cel polariteit²⁰. Inderdaad, de uitwerking van gepolariseerde arrays van stabiele MTs begeleidt veel developmental evenementen, waaronder fotoreceptor morfogenese²¹, epithelialization van cellen in de ontwikkelingslanden neurale buis¹⁸ en axon vorming⁸.

Protocol 2 beschrijft een in vivo -bewerking van een cel biologie assay voor het analyseren van MTs tijdens hun vergadering fase (nucleatie/anchorage en groei)^22,23. Ontluikende MTs zijn nucleated op de centrosoom en vervolgens verankerd aan de subdistal aanhangsels van de moeder centriool²³. Een methode voor het analyseren van de ontluikende MT hergroei na depolymerization wordt beschreven. Dit protocol bevat details over de behandeling van de nocodazole aan de depolymerize van MTs, de drug washout-procedure en de herstelperiode na de behandeling. MT uitgroei is gecontroleerd op regelmatige intervals post wassen door immunolabeling met markeringen voor totale MTs (anti β-tubuline) naast markers voor het centrosoom (anti γ-tubuline) en kern (4′, 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI)), volgens de algemene procedures beschreven in Protocol 1. De MT depolymerization stap van dit protocol is essentieel omdat hierdoor beoordeling van DOVO MT groei en uitbreiding van bestaande MTs niet. Deze techniek verschilt dus van andere gepubliceerde procedures voor het meten van MT groeicijfers (in afwezigheid van depolymerization) met behulp van een plus tip marker zoals einde bindende eiwit 3 gesmolten tot groen fluorescent proteïne (EB3-GFP), zoals in Tran et al., 2012¹¹. Bovendien, deze bepaling is met name handig voor het analyseren van de embryo’s met gebreken in DOVO MT vergadering, zoals de eerder gemelde NEDD1 mutanten waarin rekrutering van γ-tubuline tot de centrosoom bijzondere waardevermindering heeft ondergaan is, wat resulteert in onvolledige de formatie van de neurale buis en neuronale gebreken²⁴.