Fraccionamiento de Membranas Cerebrales: Un<em> Ex Vivo</em> Enfoque para evaluar la localización de proteínas subsinápticas

La transmisión sináptica se basa en la integridad física de la sinapsis, concepto que fue concebido ya en 1897 por Foster y Sherrington ¹ . Por lo tanto, la comprensión de la distribución de componentes clave de neurotransmisión ( por ejemplo, canales iónicos, receptores, etc. ) es esencial para elucidar la función sináptica, tanto en condiciones normales como patológicas. La microscopía electrónica (EM) ha contribuido enormemente a la noción ultraestructural actual de las sinapsis prototípicas del sistema nervioso central (SNC). De esta manera, EM ha establecido finamente las diferencias entre densidades pre y postsinápticas, que están separadas por una hendidura de una distancia bastante uniforme (~ 25 nm) ² . Curiosamente, el aparato postsináptico exhibe un espesamiento denso de electrones relativamente continuo por debajo de su membrana plasmática, la denominada densidad postsináptica, o PSD2. Por el contrario, en el aparato presináptico,La red cytomatrix discontinua se dispone justo debajo de la membrana plasmática, que es esencial para la alineación y acoplamiento de las vesículas sinápticas a la zona activa ^{3 de la} membrana plasmática. Por lo tanto, EM constituye el método experimental dorado para examinar la distribución de proteínas dentro de las sinapsis estructuralmente preservadas del SNC. Sin embargo, la información proporcionada por las micrografías electrónicas es estática. De hecho, las evidencias acumuladas muestran que las sinapsis in vivo son extremadamente dinámicas, experimentando cambios estructurales dramáticos tras la transmisión sináptica sostenida. Además, la morfología y composición de las sinapsis puede cambiar a lo largo de diferentes regiones del SNC y al desarrollo, maduración, envejecimiento y el desarrollo de condiciones neuropatológicas. En general, un protocolo centrado en el aislamiento de proteínas pertenecientes a diferentes compartimentos sinápticos en condiciones fisiológicas representa una herramienta valiosa para un estudio más completo del funcionamiento sináptico.

<p cAquí, describimos este tipo de enfoque experimental complementario, que permite el enriquecimiento bioquímico preparativo de los diferentes compartimentos de la membrana sináptica, a saber, los dominios de membrana extra, pre y postsináptica. Este método de fraccionamiento de membrana, descrito por primera vez por Philips et al . (2001) ⁴ , se basa en un cambio de pH que debilita las interacciones adhesivas que ocurren dentro del aparato pre y postsináptico. En primer lugar, utilizando detergentes suaves a pH 6,0, es posible discernir la unión adherente que sostiene el aparato pre y postsináptico y que se mantiene desde el dominio de la membrana extrasináptica, que se solubiliza y por lo tanto se puede extraer de los contactos sinápticos. Posteriormente, elevar el pH de 6,0 a 8,0 en presencia de detergentes suaves debilita la resistencia de la unión de adherentes que mantiene la zona presináptica activa estrechamente unida a la densidad postsináptica. Por lo tanto, el compartimiento presináptico es tanLubilizado y se puede separar de la densidad postsináptica, que se conserva en su mayor parte porque la concentración de detergente utilizado no favorece su solubilización ⁴ . Curiosamente, la eficiencia de fraccionamiento, eventualmente superior al 90%, puede ser confirmada por diferentes marcadores subsinápticos: i ) la proteína 25 asociada sinaptosomal (SNAP-25), de la zona activa presináptica; Ii ) sinaptofisina, de la fracción extrasináptica ( es decir, fuera de la zona activa e incluyendo microsomas); Y iii ) proteína de densidad postsináptica 95 (PSD-95), a partir de la densidad postsináptica. En particular, este método de fraccionamiento de membrana cerebral se ha utilizado con éxito. En consecuencia, se ha podido determinar con precisión la localización subsináptica de diferentes receptores, tales como los receptores 5 de ácido alfa-amino-3-hidroxi-5-metil-4-isoxazolpropiónico (AMPA), el receptor A1 de adenosina (A ₁ R) ⁶ ,Receptor A _{2A de} adenosina (A _2A R) ⁷ , receptores P2 de trifosfato de adenosina (ATP) ⁸ , subunidades nicotínicas de receptor de acetilcolina ⁹ y receptor GPR37 asociado con la enfermedad de Parkinson ¹⁰ . Sin embargo, una serie de limitaciones pueden impedir la evaluación adecuada de la distribución sináptica de una proteína neuronal particular. Por lo tanto, en este procedimiento, no sólo describimos completamente el protocolo completo, sino que también destacamos algunos puntos críticos a considerar, como la cantidad bastante grande de tejido necesario, el bajo rendimiento proteínico y el requisito obligatorio para validar la eficiencia de Cada separación antes de realizar el experimento definido.