Fractionnement des membranes cérébrales: une<em> Ex Vivo</em> Approche pour évaluer la localisation des protéines sous-synaptiques

La transmission synaptique repose sur l'intégrité physique de la synapse, concept qui a été envisagé dès 1897 par Foster et Sherrington ¹ . Ainsi, la compréhension de la distribution de composants clés de neurotransmission ( p. Ex., Canaux ioniques, récepteurs, etc. ) est essentielle pour élucider la fonction synaptique, tant dans des conditions normales que pathologiques. La microscopie électronique (EM) a énormément contribué à la notion ultrastructurale actuelle des synapses prototypiques du système nerveux central (SNC). De telle manière, EM a établi avec précision les différences entre les densités pré et postsynaptiques, qui sont séparées par une fente d'une distance assez uniforme (~ 25 nm) ² . Il est intéressant de noter que l'appareil postsynaptique présente un épaississement relativement continu et densifié par des électrons en dessous de sa membrane plasmatique, la densité dite post-synaptique ou PSD ² . À l'inverse, à l'appareil présynaptique,Le réseau de cytomatricies discontinues est disposé juste sous la membrane plasmique, ce qui est essentiel à l'alignement et à l'amarrage des vésicules synaptiques à la zone active de la membrane plasmatique ³ . Par conséquent, EM constitue l'approche expérimentale dorée pour enquêter sur la répartition des protéines dans les synapses du SNC structurellement préservées. Cependant, les informations fournies par les micrographies électroniques sont statiques. En effet, les preuves accumulées montrent que les synapses in vivo sont extrêmement dynamiques, connaissant ainsi des changements structurels spectaculaires lors de la transmission synaptique soutenue. En outre, la morphologie et la composition des synapses peuvent varier dans différentes régions du SNC et sur le développement, la maturation, le vieillissement et le développement de conditions neuropathologiques. Dans l'ensemble, un protocole axé sur l'isolement des protéines appartenant à différents compartiments synaptiques dans des conditions physiologiques représente un outil précieux pour une étude plus complète du fonctionnement synaptique.

<p cLass = "jove_content"> Ici, nous décrivons ce type d'approche expérimentale complémentaire, qui permet l'enrichissement biochimique préparatif des différents compartiments de membrane synaptique, à savoir les domaines de membrane extra, post-post-synaptique. Cette méthode de fractionnement de la membrane, décrite d'abord par Philips et al . (2001) ⁴ , est basé sur un changement de pH qui affaiblit les interactions adhésives se produisant dans l'appareil pré et post-synaptique. Tout d'abord, en utilisant des détergents doux à pH 6,0, il est possible de discerner la jonction adhérente qui détient l'appareil pré et post-synaptique et qui est maintenue à partir du domaine de la membrane extrasynaptique, qui est solubilisé et peut ainsi être extrait des contacts synaptiques. Par la suite, l'élévation du pH de 6,0 à 8,0 en présence de détergents doux affaiblit la résistance de la jonction adhérente qui maintient la zone active présynaptique étroitement liée à la densité postsynaptique. Par conséquent, le compartiment présynaptique est tellementLubilisé et peut être séparé de la densité postsynaptique, qui est principalement conservée car la concentration de détergent utilisée ne favorise pas sa solubilisation ⁴ . Fait intéressant, l'efficacité de fractionnement, éventuellement supérieure à 90%, peut être confirmée par différents marqueurs subsynaptiques: i ) protéine 25 synaptosomale associée (SNAP-25), de la zone active présynaptique; Ii ) la synaptophysine, à partir de la fraction extrasynaptique ( c'est-à-dire à l'extérieur de la zone active et incluant les microsomes); Et iii ) la protéine de densité postsynaptique 95 (PSD-95), à partir de la densité postsynaptique. Notamment, cette méthode de fractionnement de la membrane du cerveau a été utilisée avec succès. En conséquence, il a été possible de déterminer précisément la localisation sous-synaptique de différents récepteurs, tels que les récepteurs de l'alpha-amino-3-hydroxy-5-méthyl-4-isoxazolepropionique (AMPA) ⁵ , le récepteur de l'adénosine A ₁ (A ₁ R) ⁶ ,Les récepteurs de l'adénosine A _2A (A _2A R) ⁷ , les récepteurs P2 de l'adénosine triphosphate (ATP) ⁸ , les sous-unités du récepteur nicotinique de l'acétylcholine ⁹ et le récepteur GPR37 ¹⁰ associé à la maladie de Parkinson. Cependant, un certain nombre de limitations peuvent entraver l'évaluation correcte de la distribution synaptique d'une protéine neuronale particulière. Ainsi, dans cette procédure, nous décrivons non seulement entièrement l'intégralité du protocole, mais nous mettons également en évidence certains points critiques à considérer, tels que la quantité de tissu assez importante nécessaire, le faible rendement en protéines et l'obligation obligatoire de valider l'efficacité de Chaque séparation avant d'effectuer l'expérience définie.