Breinmembraanfractie: An<em> Ex Vivo</em> Aanpak om de subsynaptische eiwit lokalisatie te beoordelen

Synaptische transmissie berust op de fysieke integriteit van de synaps, een concept dat al in 1897 door Foster and Sherrington ^{1 was} overwogen. Zo is het begrip van de verdeling van belangrijke neurotransmissiecomponenten (bijvoorbeeld ionkanalen, receptoren, enz. ) Essentieel om de synaptische functie te verklaren, zowel in normale als pathologische omstandigheden. Elektronenmicroscopie (EM) heeft enorm bijgedragen aan de huidige ultrastructurele opvatting van synaptes van het prototypische zenuwstelsel (CNS). Zo heeft EM de fijne verschillen tussen pre- en postsynaptische dichtheden goed bepaald, die gescheiden zijn door een spleet van een vrij gelijkmatige afstand (~ 25 nm) ² . Interessant genoeg toont het postsynaptische apparaat een relatief continue, elektrondichte verdikking onder het plasmamembraan, de zogenaamde postsynaptische dichtheid of PSD ² . Omgekeerd, bij de presynaptische inrichting, een opschriftablEen discontinue cytomatrix netwerk is net onder het plasmamembraan geregeld, wat essentieel is voor het uitlijnen en docking van synaptische blaasjes aan de actieve plasmazone 3 van het plasmamembraan. Daarom vormt EM de gouden experimentele aanpak om de verdeling van eiwitten in structurele bewaarde CNS-synaptes te onderzoeken. De informatie die door elektronenmicrofotografieën wordt verstrekt is echter statisch. Inderdaad, accumulerende bewijzen tonen aan dat in vivo synapses extreem dynamisch zijn, waardoor dramatische structurele veranderingen ondervinden bij aanhoudende synaptische transmissie. Daarnaast kan de morfologie en de samenstelling van synapsen veranderen in verschillende CNS-gebieden en op ontwikkeling, rijping, veroudering en de ontwikkeling van neuropathologische aandoeningen. Over het geheel genomen is een protocol gericht op het isoleren van eiwitten die behoren tot verschillende synaptische compartimenten in fysiologische omstandigheden een waardevol instrument voor een meer uitgebreide studie van synaptische werking.

<p cLass = "jove_content"> Hier beschrijven we dit soort complementaire experimentele aanpak, die de voorbereidende biochemische verrijking van de verschillende synaptische membraancompartimenten mogelijk maakt, namelijk extra-, pre- en postsynaptische membraan domeinen. Deze membraan fractioneringswerkwijze, eerst beschreven door Philips et al . (2001) ⁴ , is gebaseerd op een pH-verschuiving die de adhesieve interacties die zich voordoen binnen de pre- en postsynaptische inrichting verzwakken. Ten eerste, door middel van milde schoonmaakmiddelen bij pH 6,0, is het mogelijk om de hechtingskoppeling te onderscheiden die het pre- en postsynaptische apparaat bevat en dat wordt gehandhaafd uit het extrasynaptische membraan domein, dat is opgelost en kan derhalve uit de synaptische contacten worden geëxtraheerd. Vervolgens verzwakt de pH van 6,0 tot 8,0 in aanwezigheid van milde detergentia de sterkte van de hechtingskoppeling die de presynaptische actieve zone strikt bindt aan de postsynaptische dichtheid. Vandaar dat het presynaptische compartiment zo isGesmoliseerd en kan worden gescheiden van de postsynaptische dichtheid, die voornamelijk wordt bewaard omdat de concentratie van het gebruikte detergent geen solubilisatie bevordert ⁴ . Interessant genoeg kan de fractioneringsefficiëntie, uiteindelijk hoger dan 90%, worden bevestigd door verschillende subsynaptische markers: i ) synaptosomaal geassocieerd eiwit 25 (SNAP-25), uit de presynaptische actieve zone; Ii ) synaptofysine, van de extrasynaptische fractie ( dwz buiten de actieve zone en met inbegrip van microsomen); En iii ) postsynaptische dichtheid eiwit 95 (PSD-95), uit de postsynaptische dichtheid. Met name is deze methode van breinmembraan fractionering succesvol gebruikt. Dienovereenkomstig is het mogelijk om de subsynaptische lokalisatie van verschillende receptoren nauwkeurig te bepalen, zoals alfa-amino-3-hydroxy-5-methyl-4-isoxazoolpropionzuur (AMPA) receptoren ⁵ , adenosine A1 receptor (A1R) ⁶ ,Adenosine A _2A receptor (A _2A R) ⁷ , adenosine trifosfaat (ATP) P2 receptoren ⁸ , nicotine acetylcholine receptor subunits ⁹ en Parkinson's geassocieerde receptor GPR37 ¹⁰ . Een aantal beperkingen kunnen echter de juiste beoordeling van de synaptische verdeling van een bepaald neuronale eiwit belemmeren. Dus in deze procedure beschrijven we niet alleen het gehele protocol, maar we beschrijven ook enkele kritische punten die overwogen moeten worden, zoals de vrij grote hoeveelheid weefsel nodig, de lage eiwitopbrengst en de verplichte eis om de efficiëntie van Elke scheiding voor het uitvoeren van het definitieve experiment.