Fracionamento de Membranas Cerebrais: Um<em> Ex Vivo</em> Abordagem para Avaliar a Localização de Proteínas Subinápticas

A transmissão sináptica baseia-se na integridade física da sinapse, um conceito que estava previsto já em 1897 por Foster e Sherrington ¹ . Assim, a compreensão da distribuição de componentes chave de neurotransmissão ( por exemplo, canais iónicos, receptores, etc. ) é essencial para elucidar a função sináptica, tanto em condições normais como patológicas. A microscopia eletrônica (EM) tem contribuído enormemente para a atual noção ultraestrutural das sinapses prototípicas do sistema nervoso central (SNC). Desta forma, EM tem finamente estabelecido as diferenças entre as densidades pré e pós-sinápticas, que são separadas por uma fenda de uma distância bastante uniforme (~ 25 nm) ² . Curiosamente, o aparelho pós-sináptico exibe um espessamento relativamente contínuo, denso de elétrons abaixo de sua membrana plasmática, a chamada densidade pós-sináptica, ou PSD2. Inversamente, no aparelho pré-sináptico,E a rede de citomatriz descontínua é disposta logo abaixo da membrana plasmática, que é essencial para o alinhamento e acoplamento das vesículas sinápticas à zona activa da membrana plasmática ³ . Assim, EM constitui a aproximação experimental dourada para pesquisar a distribuição de proteínas dentro das sinapses do SNC estruturalmente preservadas. No entanto, as informações fornecidas por micrografia eletrônica é estática. De fato, as evidências acumuladas mostram que as sinapses in vivo são extremamente dinâmicas, experimentando, assim, mudanças estruturais dramáticas na transmissão sináptica sustentada. Além disso, a morfologia e composição das sinapses podem mudar ao longo de diferentes regiões do SNC e ao desenvolvimento, maturação, envelhecimento e desenvolvimento de condições neuropatológicas. Globalmente, um protocolo focado no isolamento de proteínas pertencentes a diferentes compartimentos sinápticos em condições fisiológicas representa uma ferramenta valiosa para um estudo mais abrangente do funcionamento sináptico.

<p cAqui, descrevemos este tipo de abordagem experimental complementar, que permite o enriquecimento bioquímico preparativo dos diferentes compartimentos da membrana sináptica – a saber, domínios de membrana extra, pré e pós-sináptica. Este método de fraccionamento por membrana, descrito pela primeira vez por Philips et al . (2001) ⁴ , é baseado em um deslocamento do pH que enfraquece as interações adesivas ocorrendo dentro do aparelho pré e pós-sináptico. Em primeiro lugar, utilizando detergentes suaves a pH 6,0, é possível discernir a junção de aderentes que mantém o aparelho pré e pós-sináptico e que é mantida a partir do domínio da membrana extra-sináptica, que é solubilizada e, assim, pode ser extraída dos contatos sinápticos. Subsequentemente, aumentar o pH de 6,0 para 8,0 na presença de detergentes suaves enfraquece a resistência da junção de aderentes que mantém a zona activa pré-sináptica fortemente ligada à densidade pós-sináptica. Assim, o compartimento pré-sináptico éLubilizado e pode ser separado da densidade pós-sináptica, que é preservada principalmente porque a concentração de detergente usado não promove sua solubilização ⁴ . Curiosamente, a eficiência de fraccionamento, eventualmente superior a 90%, pode ser confirmada por diferentes marcadores sub-sinápticos: i ) proteína sinaptosomal associada 25 (SNAP-25), da zona pré-sináptica activa; Ii ) sinaptofisina, a partir da fracção extra-sináptica ( isto é, fora da zona activa e incluindo microssomas); E iii ) proteína de densidade pós-sináptica 95 (PSD-95), a partir da densidade pós-sináptica. Notavelmente, este método de fraccionamento de membrana cerebral tem sido utilizado com sucesso. Consequentemente, tem sido possível determinar com precisão a localização subsináptica de diferentes receptores, tais como receptores 5 de ácido alfa-amino-3-hidroxi-5-metil-4-isoxazolepropiónico (AMPA), receptor A1 de adenosina (AiR) ⁶ ,Receptor A _2A (A _2A R) ^{7 de} adenosina, receptores P2 de trifosfato de adenosina (ATP) ⁸ , subunidades nicotínicas do receptor de acetilcolina ⁹ e receptor GPR37 associado à doença de Parkinson ¹⁰ . No entanto, uma série de limitações podem impedir a avaliação adequada da distribuição sináptica de uma determinada proteína neuronal. Desta forma, neste procedimento, não apenas descrevemos totalmente o protocolo, como também destacamos alguns pontos críticos a serem considerados, como a grande quantidade de tecido necessário, o baixo rendimento protéico eo requisito obrigatório para validar a eficiência de Cada separação antes de realizar a experiência definida.