Фракционирование мозговых мембран:<em> Ex Vivo</em> Подход к оценке локализации сусинаптических белков

Синаптическая передача основывается на физической целостности синапса, концепции, которая была предусмотрена еще в 1897 году Фостером и Шеррингтоном ¹ . Таким образом, понимание распределения ключевых компонентов нейротрансмиссии ( например, ионных каналов, рецепторов и т . Д.) Необходимо для выяснения синаптической функции как в нормальных, так и в патологических состояниях. Электронная микроскопия (ЭМ) внесла огромный вклад в современное ультраструктурное представление синапсов прототипической центральной нервной системы (ЦНС). Таким образом, ЭМ точно установила разницу между до- и постсинаптической плотностью, разделенными расщелиной на довольно равномерном расстоянии (~ 25 нм) ² . Интересно, что постсинаптический аппарат имеет относительно непрерывное, электронно-плотное утолщение под его плазматической мембраной, так называемую постсинаптическую плотность, или PSD ² . Напротив, в пресинаптическом аппарате заметнаE разрывная цитоматричная сеть расположена непосредственно под плазматической мембраной, которая необходима для выравнивания и стыковки синаптических везикул с активной зоной плазматической мембраны ³ . Следовательно, ЭМ представляет собой золотой экспериментальный подход к исследованию распределения белков в структурно сохраненных синапсах CNS. Однако информация, предоставленная электронными микрофотографиями, является статичной. Действительно, накапливающиеся свидетельства показывают, что синапсы in vivo чрезвычайно динамичны, и поэтому испытывают серьезные структурные изменения при длительной синаптической передаче. Кроме того, морфология и состав синапсов могут изменяться в разных областях ЦНС, а также при развитии, созревании, старении и развитии невропатологических состояний. В целом протокол, посвященный изоляции белков, принадлежащих к разным синаптическим компартментам в физиологических условиях, представляет собой ценный инструмент для более полного исследования синаптического функционирования.

<p cLass = "jove_content"> Здесь мы описываем этот тип дополнительного экспериментального подхода, который позволяет получить препаративное биохимическое обогащение различных отделений синаптических мембран, а именно, экстра-, пре- и постсинаптические мембранные домены. Этот способ мембранного фракционирования, впервые описанный Philips и др . (2001) ⁴ , основан на сдвиге рН, который ослабляет адгезивные взаимодействия, происходящие в пред- и постсинаптической аппаратуре. Во-первых, используя мягкие моющие средства при рН 6,0, можно обнаружить адгезионный переход, который удерживает пред- и постсинаптический аппарат, и который поддерживается из области экстрасинаптической мембраны, которая солюбилизирована и, таким образом, может быть извлечена из синаптических контактов. Впоследствии повышение рН от 6,0 до 8,0 в присутствии слабых детергентов ослабляет прочность адгезивного соединения, которое удерживает пресинаптически активную зону плотно связанной с постсинаптической плотностью. Следовательно, пресинаптическое отделение настолькоЛибилизируется и может быть отделена от постсинаптической плотности, которая в основном сохраняется, поскольку концентрация используемого детергента не способствует его солюбилизации ⁴ . Интересно, что эффективность фракционирования, в конечном итоге выше 90%, может быть подтверждена различными субсинаптическими маркерами: i ) синаптосомальный белок 25 (SNAP-25) из пресинаптической активной зоны; Ii) синаптофизин из экстрасинаптической фракции ( т.е. вне активной зоны и включая микросомы); И iii ) постсинаптический белок плотности 95 (PSD-95), из постсинаптической плотности. Примечательно, что этот метод фракционирования головного мозга успешно использовался. Соответственно, было возможно точно определить субсинаптическую локализацию различных рецепторов, таких как рецепторы альфа-амино-3-гидрокси-5-метил-4-изоксазолпропионовой кислоты (АМРА) ⁵ , рецептор аденозина A ₁ (A ₁ R) ⁶ ,Аденозиновый рецептор А _2А (A ₂ A R) ⁷ , рецепторы Р2 аденозинтрифосфата (АТФ) ⁸ , субъединицы ⁹ никотинового ацетилхолина и рецептор, ассоциированный с болезнью Паркинсона GPR37 ¹⁰ . Однако ряд ограничений может помешать правильной оценке синаптического распределения конкретного нейронального белка. Таким образом, в этой процедуре мы не только полностью описываем весь протокол, но также выделяем некоторые критические моменты, которые необходимо учитывать, например, достаточно большое количество ткани, низкий выход белка и обязательное требование проверки эффективности Каждое разделение перед выполнением определенного эксперимента.