Frazione di membrana del cervello: An<em> Ex Vivo</em> Approccio per valutare la localizzazione della proteina subsynaptica

La trasmissione sinaptica si basa sull'integrità fisica della sinapsi, un concetto che era stato previsto già nel 1897 da Foster e Sherrington ¹ . Così, la comprensione della distribuzione dei componenti chiave di neurotrasmissione ( es. Canali ionici, recettori, ecc. ) È essenziale per chiarire la funzione sinaptica, sia in condizioni normali che patologiche. La microscopia elettronica (EM) ha contribuito enormemente all'attuale nozione ultrastrutturale delle sinapsi prototipali del sistema nervoso centrale (CNS). In tal modo, EM ha stabilito finemente le differenze tra densità pre- e postinaptica, che sono separate da una fessura di una distanza piuttosto uniforme (~ 25 nm) ² . È interessante notare che l'apparato postinaptico presenta un ispessimento relativamente continuo, elettrone-denso, sotto la sua membrana plasmatica, la cosiddetta densità postinaptica o PSD ² . Al contrario, all'apparato presinaptico, un avvisoLa rete cytomatica discontinua è disposta appena sotto la membrana plasmatica, che è essenziale per l'allineamento e l'ancoraggio delle vescicole sinaptiche alla zona attiva della membrana plasmatica ³ . Quindi, EM costituisce l'approccio sperimentale d'oro per studiare la distribuzione delle proteine ​​all'interno di sinapsi CNS strutturalmente conservati. Tuttavia, le informazioni fornite da microscopi elettronici sono statici. Infatti, le evidenze accumulate mostrano che le sinapsi in vivo sono estremamente dinamiche, provando quindi drammatiche modifiche strutturali alla trasmissione sinaptica sostenuta. Inoltre, la morfologia e la composizione delle sinapsi possono cambiare in diverse regioni del CNS e su sviluppo, maturazione, invecchiamento e sviluppo di condizioni neuropatologiche. Nel complesso, un protocollo focalizzato sull'isolamento di proteine ​​appartenenti a diversi compartimenti sinaptici in condizioni fisiologiche rappresenta uno strumento prezioso per uno studio più completo del funzionamento sinaptico.

<p cQui descriviamo questo tipo di approccio sperimentale complementare, che consente l'arricchimento biochimico preparatorio dei diversi compartimenti sinaptici della membrana, vale a dire domini a membrana extra-, pre- e postsynaptici. Questo metodo di frazionamento della membrana, descritto per la prima volta da Philips et al . (2001) ⁴ , si basa su un cambiamento di pH che indebolisce le interazioni adesive che si verificano all'interno dell'apparato pre- e postinaptico. In primo luogo, utilizzando detergenti delicati a pH 6,0, è possibile distinguere la giunzione aderente che contiene l'apparato pre- e postsinaptico e che viene mantenuto dal dominio della membrana extrasynaptica, che è solubilizzato e quindi può essere estratto dai contatti sinaptici. Successivamente, sollevando il pH da 6,0 a 8,0 in presenza di detergenti delicati, indebolisce la forza della giunzione aderente che mantiene la zona attiva presinaptica strettamente legata alla densità postinaptica. Quindi, lo scompartimento presinaptico è cosìLubrificata e può essere separata dalla densità postsinaptica, che è per lo più conservata perché la concentrazione del detergente utilizzato non promuove la sua solubilizzazione ⁴ . È interessante notare che l'efficienza di frazionamento, eventualmente superiore al 90%, può essere confermata da diversi marcatori sottosintesi: i ) la proteina associata alla sinaptosoma 25 (SNAP-25), dalla zona attiva presinaptica; Ii ) sinaptofisina, dalla frazione extrasinaptica ( cioè, al di fuori della zona attiva e microsomi inclusi); E iii ) proteina densità postinaptica 95 (PSD-95), dalla densità postinaptica. In particolare, questo metodo di frazionamento della membrana cerebrale è stato utilizzato con successo. Di conseguenza, è stato possibile determinare con precisione la localizzazione subsynaptica di diversi recettori, quali i recettori 5 dell'acido alfa-ammino-3-idrossi-5-metil-4-isossazolepropionico (AMPA), il recettore dell'adenosina A1 (A ₁ R) ⁶ ,Adenosina A _2A (A _2A R) ⁷ , adenosine trifosfato (ATP) P2, ⁸ recettori recettori del acetilcolino nicotinico ⁹ e recettore GPR3710 associato alla malattia di Parkinson. Tuttavia, una serie di limitazioni può ostacolare la corretta valutazione della distribuzione sinaptica di una particolare proteina neuronale. Quindi, in questa procedura, non solo descriviamo completamente l'intero protocollo, ma evidenziamo anche alcuni punti critici da prendere in considerazione, come la quantità piuttosto elevata di tessuti necessari, la bassa resa proteica e il requisito obbligatorio per convalidare l'efficienza Ogni separazione prima di eseguire l'esperimento definito.