Embriyonik Anjiyojenezin Görselleştirilmesi ve Nicel Analizi<emXenopus tropicalis</em
Summary
Bu protokol, vaskülatürü görselleştirmek ve Xenopus tropicalis'deki karmaşıklığını niceleştirmek için flüorüre dayalı bir yöntemi göstermektedir . İn vivo kardiyovasküler gelişimi incelemek için genetik ve / veya farmakolojik manipülasyonlardan sonra bir embriyonun kalp atımına floresan bir boya enjekte edildikten birkaç dakika sonra kan damarları görüntülenebilir.
Abstract
Kan damarları vücuda oksijen ve besin sağlarlar ve vasküler ağ oluşumu sıkı gelişim kontrolü altındadır. Kan damarlarının etkili in vivo görselleştirilmesi ve karmaşıklığının güvenilir bir şekilde ölçülmesi, damar şebekesinin biyolojisi ve hastalığını anlamanın anahtarıdır. Burada, piyasada bulunan bir flüoresan boya, insan plazması asetillenmiş düşük yoğunluklu lipoprotein DiI kompleksi (DiI-AcLDL) ile kan damarlarını görselleştirmek ve Xenopus tropicalis'deki karmaşıklığını ölçmek için ayrıntılı bir yöntem sunuyoruz . Kan damarları, bir embriyonun atan kalbine basit bir DiI-AcLDL enjeksiyonuyla etiketlenebilir ve tüm embriyo içindeki kan damarları canlı veya sabit embriyolarda görüntülenebilir. Nükleik asitlerin hedeflenen mikroenjeksiyonu ve / veya farmakolojik reaktiflerin banyo uygulaması ile gen pertürbasyonuyla kombine edildiğinde, bir genin veya sinyal yolunun vasküler gelişim üzerindeki rolleri inve edilebilirSofistike genetik mühendisliğe tabi tutulmuş hayvanlara başvurmadan bir hafta içinde denendi. Xenopus'un iyi tanımlanmış venöz sistemi ve stereotipik anjiyojenezinden dolayı, var olan damarların filizlenmesi, karmaşıklık, pertürbasyon deneylerinden sonra verimli bir şekilde nicelleştirilebilir. Bu nispeten basit protokol, çeşitli kardiyovasküler araştırmalarda kolay erişilebilir bir araç olarak kullanılmalıdır.
Introduction
Vaskülojenez, yeni doğan endotel hücrelerinden yeni kan damarlarının oluşumu ve önceden var olan damarlardan yeni damarların oluşumu olan anjiyogenez, embriyonik vaskülatürü şekillendiren iki ayrı süreçtir 1 . Bu işlemlerdeki herhangi bir düzensizlik, çeşitli kalp hastalıklarına ve damarların yapısal anormalliklerine neden olur. Dahası, tümör büyümesi, kontrolsüz damar büyümesi ile ilişkilidir. Bu nedenle, vaskülojenezin ve anjiyogenezinin altında yatan moleküler mekanizmalar yoğun araştırma konusudır 2 .
Xenopus ve zebra balığı çeşitli nedenlerle vaskülogenez ve anjiyogenez çalışmaları için cazip omurgalı modelleridir. Birincisi, embriyoları küçüktür; Bu nedenle, tüm vaskülatürün görüntüsünü görmek nispeten kolaydır. İkincisi, embriyonik gelişme hızlıdır; Tüm vaskülatürün gelişmesi yalnızca birkaç gün alır, bu süre boyunca gelişmekte olan vaskül Resimlenebilir. Üçüncü olarak, gelişmekte olan embriyoya antisens morfolino nükleotidlerinin (MO'lar) mikroenjeksiyon veya ilaçlar 3 , 4 , 5'in banyo uygulaması yoluyla uygulanması gibi, damar oluşumu öncesi ve sırasında genetik ve farmakolojik müdahalelerin gerçekleştirilmesi kolaydır.
Xenopus'un zebra balığı üzerindeki benzersiz avantajı, Xenopus'un stereotipik holoblastik bölünmeleri izlemesi ve embriyonik kader haritasının iyi tanımlanmış olması nedeniyle 6 embriyolojik manipülasyonların gerçekleştirilebilmesidir. Örneğin, iki hücreli evredeki bir hücrede bir antisense MO enjekte edilerek yalnızca bir yanal bölgenin genetik olarak manipüle edildiği bir embriyo üretmek mümkündür. Kalbin primordiumun bir embriyodan diğerine nakledilmesi, genin işlevini hücre içi veya ekstrensek mekanizma ile uygulayıp uygulamadığını belirlemek de mümkündürAss = "xref"> 7. Bu teknikler çoğunlukla allotetraploid olan ve bu nedenle genetik araştırmalar için ideal olmayan Xenopus laevis'de geliştirilmiş olmakla birlikte , yakından ilişkili bir diploid tür olan Xenopus tropikalis'e doğrudan uygulanabilirler8 .
Canlı bir Xenopus embriyosunda vaskülatürün görselleştirilmesinin bir yolu, kan damarlarını etiketlemek için bir flüoresan boya enjekte etmektir. DiI gibi bir floresan molekülü ile etiketlenmiş asetillenmiş düşük yoğunluklu lipoprotein (AcLDL) çok yararlı bir probdur. Asetilasid LDL'nin aksine, AcLDL LDL reseptörüne 9 bağlamaz, ancak makrofajlar ve endotel hücreleri tarafından endositize edilir. Canlı bir hayvanın kalbine DiI-AcLDL enjeksiyonu, endotel hücrelerinin spesifik flüoresan etiketlenişiyle sonuçlanır ve tüm vaskülatür, canlı veya sabit embriyoların flüoresan mikroskopisi ile görüntülenebilir.
İşte biz presXenopus tropikalis'teki DiI -AcLDL'yi kullanarak kan damarlarının görüntülenmesi ve nicelenmesi için ayrıntılı protokoller ( Şekil 1 ). Başarılı ve başarısız deney örnekleri ile önemli pratik noktalar sağlarız. Buna ek olarak, vasküler ağın şekillendirilmesinde genetik ve çevresel faktörlerin etkilerini değerlendirmede yararlı olabilecek, vasküler kompleksitenin kantitatif analizi için basit bir yöntem sunuyoruz.
Protocol
Representative Results
Discussion
Burada sunulan protokol ilk olarak Xenopus laevis 4'te vasküler oluşum sırasında gelişme olaylarını araştırmak için Ali H. Brivanlou ve arkadaşları tarafından geliştirildi, ancak bu el yazmasında gösterildiği gibi diğer küçük hayvanlara uygulanabilir. Kalbe boya enjeksiyonu gerçekleştirmek kolaydır ve tüm vasküler ağ, bir floresan diseksiyon mikroskopu altında bir konfokal mikroskop altında görüntülenebilir. Boya damar gelişiminde kalbe enjekte edilir…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Bu çalışma Levine ve ark.'nın eserlerinden esinlenmiştir. , Bu deneysel yöntemi açıkladı ve Xenopus laevis'teki vasküler gelişimin kapsamlı bir tanımını sağladı . Girişleri için laboratuvarımızın üyelerine teşekkür ediyoruz. Bu çalışma, 2015 Yonsei Üniversitesi'nin Geleceğin Öncü Araştırma Girişimi (2015-22- 0095) ve Bilim, BİT ve Gelecek Planlama Bakanlığı tarafından finanse edilen Ulusal Araştırma Vakfı'nın (NRF) Biyo ve Tıbbi Teknoloji Geliştirme Programı tarafından desteklenmektedir ( NMK-2013M3A9D5072551)
Materials
| 35mm Petri dish | SPL | 10035 | Sylgard mold frame |
| 60mm Petri dish | SPL | 10060 | Embryo raising tray |
| Borosilicate Glass | Sutter instrument | B100-50-10 | Needle for injection |
| BSA | Sigma | A3059-10G | Coating reagent |
| CaCl2 | D.S.P.GR Reagent | 0.1X MBS component | |
| Coverslip | Superior | HSU-0111520 | For confocal imaging |
| DiI-AcLDL | Thermo Fisher Scientific | L3484 | Vessel staining solution |
| FBS | Hyclone | SH.30919.02 | For storage of testis |
| Fiber Optical Illuminator | World Precision Instruments | Z-LITE-Z | Light |
| Ficoll | Sigma | F4375 | Injection buffer |
| Flaming/Brown Micropipette Puller | Sutter instrument | P-97 | Injection needle puller |
| Forcep | Fine Science Tool | 11255-20 | For embryo hatching and needle tip cutting |
| Glass Bottom dish | SPL | 100350 | For confocal imaging |
| hCG | MNS Korea | For priming of frogs | |
| HEPES | Sigma | H3375 | Buffering agent |
| Incubator | Lab. Companion | ILP-02 | For raising embryos |
| KCl | DAEJUNG | 6566-4400 | MBS component |
| L15 medium | Gibco | 11415-114 | For storage of testis |
| L-cysteine | Sigma | 168149-100G | De-jellying reagent |
| MgSO4 | Sigma | M7506 | MBS component |
| Microtube | Axygen | MCT-175-C-S | For storage of testis |
| MS222 | Sigma | E10521 | Anesthetic powder |
| NaCl | DAEJUNG | 7647-14-5 | MBS component |
| NaOH | Sigma | S-0899 | pH adjusting reagent |
| Paraformaldehyde | Sigma | P6148 | Fixatives |
| PBS | BIOSESANG | P2007 | Buffer for imaging |
| pH paper | Sigma | P4536-100EA | For confirming pH |
| PICO-LITER INJECTOR | Waner instruments | PLI-100A | For injection |
| Pin | Pinservice | 26002-10 | For incision |
| Pinholder | Scitech Korea | 26016-12 | For incision |
| Precision Stereo Zoom Binocular Microscope | World Precision Instruments | PZMIII | For visual screening |
| Standard Manual Control Micromanipulator | Waner instruments | W4 64-0056 | For microinjection |
| SYLGARD 184 Kit | Dow Corning | For DiI injection | |
| Transfer pipette | Korea Ace Scientific Co. | YM.B78-400 | For eggs and embryo collection |
References
- Herbert, S. P., Stainier, D. Y. Molecular control of endothelial cell behaviour during blood vessel morphogenesis. Nat Rev Mol Cell Biol. 12 (9), 551-564 (2011).
- Augustin, H. G., Koh, G. Y., Thurston, G., Alitalo, K. Control of vascular morphogenesis and homeostasis through the angiopoietin-Tie system. Nat Rev Mol Cell Biol. 10 (3), 165-177 (2009).
- Lawson, N. D., Weinstein, B. M. Arteries and veins: making a difference with zebrafish. Nat Rev Genet. 3 (9), 674-682 (2002).
- Levine, A. J., Munoz-Sanjuan, I., Bell, E., North, A. J., Brivanlou, A. H. Fluorescent labeling of endothelial cells allows in vivo, continuous characterization of the vascular development of Xenopus laevis. Dev Biol. 254 (1), 50-67 (2003).
- Yang, C., et al. Calmodulin Mediates Ca2+-Dependent Inhibition of Tie2 Signaling and Acts as a Developmental Brake During Embryonic Angiogenesis. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 36 (7), 1406-1416 (2016).
- Moody, S. A. Fates of the blastomeres of the 32-cell-stage Xenopus embryo. Dev Biol. 122 (2), 300-319 (1987).
- Elliott, K. L., Houston, D. W., Fritzsch, B. Transplantation of Xenopus laevis tissues to determine the ability of motor neurons to acquire a novel target. PLoS One. 8 (2), 55541 (2013).
- Grainger, R. M. Xenopus tropicalis as a model organism for genetics and genomics: past, present, and future. Methods Mol Biol. 917, 3-15 (2012).
- Weisgraber, K. H., Innerarity, T. L., Mahley, R. W. Role of lysine residues of plasma lipoproteins in high affinity binding to cell surface receptors on human fibroblasts. J Biol Chem. 253 (24), 9053-9062 (1978).
- Showell, C., Conlon, F. L. Egg collection and in vitro fertilization of the western clawed frog Xenopus tropicalis. Cold Spring Harb Protoc. 2009 (9), 5293 (2009).
- Nieuwkoop, P. D., Faber, J. . Normal Table of Xenopus laevis (Daudin). , (1956).
- Longair, M. H., Baker, D. A., Armstrong, J. D. Simple Neurite Tracer: open source software for reconstruction, visualization and analysis of neuronal processes. Bioinformatics. 27 (17), 2453-2454 (2011).
- Marshak, S., Nikolakopoulou, A. M., Dirks, R., Martens, G. J., Cohen-Cory, S. Cell-autonomous TrkB signaling in presynaptic retinal ganglion cells mediates axon arbor growth and synapse maturation during the establishment of retinotectal synaptic connectivity. J Neurosci. 27 (10), 2444-2456 (2007).
- Cha, H. J., et al. Evolutionarily repurposed networks reveal the well-known antifungal drug thiabendazole to be a novel vascular disrupting agent. PLoS Biol. 10 (8), 1001379 (2012).
- Ny, A., et al. A transgenic Xenopus laevis reporter model to study lymphangiogenesis. Biol Open. 2 (9), 882-890 (2013).
- Bussmann, J., et al. Arteries provide essential guidance cues for lymphatic endothelial cells in the zebrafish trunk. Development. 137 (16), 2653-2657 (2010).
- Li, X. M., Hu, Z., Jorgenson, M. L., Slayton, W. B. High levels of acetylated low-density lipoprotein uptake and low tyrosine kinase with immunoglobulin and epidermal growth factor homology domains-2 (Tie2) promoter activity distinguish sinusoids from other vessel types in murine bone marrow. Circulation. 120 (19), 1910-1918 (2009).
