Visualizzazione e analisi quantitativa di angiogenesi embrionale in<em> Xenopus tropicalis</em
Summary
Questo protocollo dimostra un metodo basato su fluorescenza per visualizzare la vascolarizzazione e per quantificare la sua complessità in Xenopus tropicalis . I vasi sanguigni possono essere immagazzinati minuti dopo l'iniezione di un colorante fluorescente nel cuore battente di un embrione dopo manipolazioni genetiche e / o farmacologiche per studiare lo sviluppo cardiovascolare in vivo .
Abstract
I vasi sanguigni forniscono ossigeno e sostanze nutritive in tutto il corpo, e la formazione della rete vascolare è sotto stretto controllo dello sviluppo. L'efficace visualizzazione in vivo dei vasi sanguigni e la quantificazione affidabile della loro complessità sono fondamentali per comprendere la biologia e la malattia della rete vascolare. Qui forniamo un metodo dettagliato per la visualizzazione dei vasi sanguigni con un colorante fluorescente disponibile in commercio, il complesso di Di-AcLDL lipoproteinico a bassa densità acetilato plasmatico umano (DiI-AcLDL) e per quantificare la loro complessità in Xenopus tropicalis . I vasi sanguigni possono essere etichettati con una semplice iniezione di Di-AcLDL nel cuore battente di un embrione ei vasi sanguigni in tutto l'embrione possono essere immaginati in embrioni vivi o fissi. Combinata con la perturbazione del gene mediante la microinezione mirata di acidi nucleici e / o l'applicazione del bagno di reagenti farmacologici, i ruoli di un gene o di un percorso di segnalazione sullo sviluppo vascolare possono essere inveStregata entro una settimana senza ricorrere a sofisticati animali geneticamente modificati. A causa del sistema venoso ben definito di Xenopus e della sua angiogenesi stereotipica, lo spruzzo di vasi preesistenti, la complessità dei vasi può essere quantificata in modo efficiente dopo gli esperimenti di perturbazione. Questo protocollo relativamente semplice dovrebbe servire come strumento facilmente accessibile in diversi settori della ricerca cardiovascolare.
Introduction
La vasculogenesi, la formazione di nuovi vasi sanguigni delle cellule endoteliali appena nate e l'angiogenesi, la formazione di nuovi vasi da recipienti preesistenti, sono due processi distinti che formano la vasculatura embrionale 1 . Qualsiasi disregolazione in questi processi provoca diverse malattie cardiache e anomalie strutturali delle navi. Inoltre, la crescita tumorale è associata a una crescita incontrollata dei vasi. Come tali, i meccanismi molecolari che sottendono la vasculogenesi e l'angiogenesi sono oggetto di un'intensa ricerca 2 .
Xenopus e zebrafish sono modelli vertebrati attraenti per studi di vasculogenesi e angiogenesi, per diversi motivi. In primo luogo, i loro embrioni sono piccoli; Pertanto, è relativamente facile immaginare l'intera vascolarizzazione. Secondo, lo sviluppo embrionale è rapido; Ci vorranno solo un paio di giorni per sviluppare l'intera vasculatura, durante il quale la vascul in via di sviluppo Può essere ripresa. Terzo, gli interventi genetici e farmacologici prima e durante la formazione della nave sono facili da eseguire, come per esempio attraverso la microinezione di anticorpi nucleotidi morfologici (MOs) nell'embrione in via di sviluppo o attraverso l'applicazione della droga dei farmaci 3 , 4 , 5 .
Il vantaggio unico di Xenopus sullo zebrafish è che le manipolazioni embriologiche possono essere eseguite poiché Xenopus segue scomponi stereotipari olooblastici e la mappa del destino embrionale è ben definita 6 . Ad esempio, è possibile generare un embrione in cui solo un lato laterale viene manipolato geneticamente iniettando un MO antisenso a una sola cellula a due stadi. È anche possibile trapianto il primordio cardiaco da un embrione all'altro per determinare se il gene esercita la sua funzione da un meccanismo intrinseco o extrinsico a celluleAss = "xref"> 7. Anche se queste tecniche sono state sviluppate per lo più in Xenopus laevis , che è allotetraploide e quindi non è ideale per gli studi genetici, possono essere direttamente applicati a Xenopus tropicalis , una specie diploide strettamente correlata 8 .
Un modo per visualizzare la vascolarizzazione in un embrione live Xenopus è quello di iniettare un colorante fluorescente per etichettare i vasi sanguigni. La lipoproteina a bassa densità acetilata (AcLDL) etichettata con una molecola fluorescente come DiI è una sonda molto utile. A differenza di LDL nonacetilato, AcLDL non si lega al recettore LDL 9 ma è endocitata da macrofagi e cellule endoteliali. L'iniezione di DiI-AcLDL nel cuore di un animale vivo produce l'etichettatura fluorescente specifica delle cellule endoteliali e l'intera vascolarizzazione può essere rappresentata mediante microscopia a fluorescenza in embrioni vivi o fissi 4 .
Qui, ci aspettiamoI protocolli dettagliati per la visualizzazione e la quantificazione dei vasi sanguigni usando DiI-AcLDL in Xenopus tropicalis ( Figura 1 ). Forniamo punti chiave pratici, con esempi di esperimenti di successo e non riusciti. Inoltre, forniamo un metodo diretto per l'analisi quantitativa della complessità vascolare, che potrebbe essere utile per valutare gli effetti dei fattori genetici e ambientali sulla formazione della rete vascolare.
Protocol
Representative Results
Discussion
Il protocollo qui presentato è stato innanzitutto sviluppato da Ali H. Brivanlou e colleghi per indagare gli eventi di sviluppo durante la formazione vascolare in Xenopus laevis 4 , ma, come mostrato in questo manoscritto, può essere applicato ad altri piccoli animali. L'iniezione di tintura nel cuore è semplice da eseguire, e l'intera rete vascolare può essere ripresa in un microscopio di dissezione a fluorescenza, così come un microscopio confocale. Se il colorante viene i…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Questo studio è stato ispirato dall'opera di Levine et al. , Che descriveva questo metodo sperimentale e forniva una descrizione completa dello sviluppo vascolare in Xenopus laevis. Ringraziamo i membri del nostro laboratorio per il loro contributo. Questo studio è stato sostenuto dall'iniziativa di ricerca futura diretta dell'università di Yonsei 2015 (2015-22- 0095) e dal Programma di Sviluppo Tecnologico Bio & Medical della Fondazione Nazionale di Ricerca (NRF) finanziato dal Ministero della Scienza, delle TIC e del Futuro Pianificazione ( NRF-2013M3A9D5072551)
Materials
| 35mm Petri dish | SPL | 10035 | Sylgard mold frame |
| 60mm Petri dish | SPL | 10060 | Embryo raising tray |
| Borosilicate Glass | Sutter instrument | B100-50-10 | Needle for injection |
| BSA | Sigma | A3059-10G | Coating reagent |
| CaCl2 | D.S.P.GR Reagent | 0.1X MBS component | |
| Coverslip | Superior | HSU-0111520 | For confocal imaging |
| DiI-AcLDL | Thermo Fisher Scientific | L3484 | Vessel staining solution |
| FBS | Hyclone | SH.30919.02 | For storage of testis |
| Fiber Optical Illuminator | World Precision Instruments | Z-LITE-Z | Light |
| Ficoll | Sigma | F4375 | Injection buffer |
| Flaming/Brown Micropipette Puller | Sutter instrument | P-97 | Injection needle puller |
| Forcep | Fine Science Tool | 11255-20 | For embryo hatching and needle tip cutting |
| Glass Bottom dish | SPL | 100350 | For confocal imaging |
| hCG | MNS Korea | For priming of frogs | |
| HEPES | Sigma | H3375 | Buffering agent |
| Incubator | Lab. Companion | ILP-02 | For raising embryos |
| KCl | DAEJUNG | 6566-4400 | MBS component |
| L15 medium | Gibco | 11415-114 | For storage of testis |
| L-cysteine | Sigma | 168149-100G | De-jellying reagent |
| MgSO4 | Sigma | M7506 | MBS component |
| Microtube | Axygen | MCT-175-C-S | For storage of testis |
| MS222 | Sigma | E10521 | Anesthetic powder |
| NaCl | DAEJUNG | 7647-14-5 | MBS component |
| NaOH | Sigma | S-0899 | pH adjusting reagent |
| Paraformaldehyde | Sigma | P6148 | Fixatives |
| PBS | BIOSESANG | P2007 | Buffer for imaging |
| pH paper | Sigma | P4536-100EA | For confirming pH |
| PICO-LITER INJECTOR | Waner instruments | PLI-100A | For injection |
| Pin | Pinservice | 26002-10 | For incision |
| Pinholder | Scitech Korea | 26016-12 | For incision |
| Precision Stereo Zoom Binocular Microscope | World Precision Instruments | PZMIII | For visual screening |
| Standard Manual Control Micromanipulator | Waner instruments | W4 64-0056 | For microinjection |
| SYLGARD 184 Kit | Dow Corning | For DiI injection | |
| Transfer pipette | Korea Ace Scientific Co. | YM.B78-400 | For eggs and embryo collection |
References
- Herbert, S. P., Stainier, D. Y. Molecular control of endothelial cell behaviour during blood vessel morphogenesis. Nat Rev Mol Cell Biol. 12 (9), 551-564 (2011).
- Augustin, H. G., Koh, G. Y., Thurston, G., Alitalo, K. Control of vascular morphogenesis and homeostasis through the angiopoietin-Tie system. Nat Rev Mol Cell Biol. 10 (3), 165-177 (2009).
- Lawson, N. D., Weinstein, B. M. Arteries and veins: making a difference with zebrafish. Nat Rev Genet. 3 (9), 674-682 (2002).
- Levine, A. J., Munoz-Sanjuan, I., Bell, E., North, A. J., Brivanlou, A. H. Fluorescent labeling of endothelial cells allows in vivo, continuous characterization of the vascular development of Xenopus laevis. Dev Biol. 254 (1), 50-67 (2003).
- Yang, C., et al. Calmodulin Mediates Ca2+-Dependent Inhibition of Tie2 Signaling and Acts as a Developmental Brake During Embryonic Angiogenesis. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 36 (7), 1406-1416 (2016).
- Moody, S. A. Fates of the blastomeres of the 32-cell-stage Xenopus embryo. Dev Biol. 122 (2), 300-319 (1987).
- Elliott, K. L., Houston, D. W., Fritzsch, B. Transplantation of Xenopus laevis tissues to determine the ability of motor neurons to acquire a novel target. PLoS One. 8 (2), 55541 (2013).
- Grainger, R. M. Xenopus tropicalis as a model organism for genetics and genomics: past, present, and future. Methods Mol Biol. 917, 3-15 (2012).
- Weisgraber, K. H., Innerarity, T. L., Mahley, R. W. Role of lysine residues of plasma lipoproteins in high affinity binding to cell surface receptors on human fibroblasts. J Biol Chem. 253 (24), 9053-9062 (1978).
- Showell, C., Conlon, F. L. Egg collection and in vitro fertilization of the western clawed frog Xenopus tropicalis. Cold Spring Harb Protoc. 2009 (9), 5293 (2009).
- Nieuwkoop, P. D., Faber, J. . Normal Table of Xenopus laevis (Daudin). , (1956).
- Longair, M. H., Baker, D. A., Armstrong, J. D. Simple Neurite Tracer: open source software for reconstruction, visualization and analysis of neuronal processes. Bioinformatics. 27 (17), 2453-2454 (2011).
- Marshak, S., Nikolakopoulou, A. M., Dirks, R., Martens, G. J., Cohen-Cory, S. Cell-autonomous TrkB signaling in presynaptic retinal ganglion cells mediates axon arbor growth and synapse maturation during the establishment of retinotectal synaptic connectivity. J Neurosci. 27 (10), 2444-2456 (2007).
- Cha, H. J., et al. Evolutionarily repurposed networks reveal the well-known antifungal drug thiabendazole to be a novel vascular disrupting agent. PLoS Biol. 10 (8), 1001379 (2012).
- Ny, A., et al. A transgenic Xenopus laevis reporter model to study lymphangiogenesis. Biol Open. 2 (9), 882-890 (2013).
- Bussmann, J., et al. Arteries provide essential guidance cues for lymphatic endothelial cells in the zebrafish trunk. Development. 137 (16), 2653-2657 (2010).
- Li, X. M., Hu, Z., Jorgenson, M. L., Slayton, W. B. High levels of acetylated low-density lipoprotein uptake and low tyrosine kinase with immunoglobulin and epidermal growth factor homology domains-2 (Tie2) promoter activity distinguish sinusoids from other vessel types in murine bone marrow. Circulation. 120 (19), 1910-1918 (2009).
