Visualisation et analyse quantitative de l'angiogenèse embryonnaire dans<em> Xenopus tropicalis</em
Summary
Ce protocole démontre une méthode à base de fluorescence pour visualiser le système vasculaire et pour quantifier sa complexité chez Xenopus tropicalis . Les vaisseaux sanguins peuvent être imagés quelques minutes après l'injection d'un colorant fluorescent dans le coeur battant d'un embryon après des manipulations génétiques et / ou pharmacologiques pour étudier le développement cardiovasculaire in vivo .
Abstract
Les vaisseaux sanguins fournissent de l'oxygène et des nutriments dans tout le corps, et la formation du réseau vasculaire est soumise à un contrôle étroit du développement. La visualisation efficace in vivo des vaisseaux sanguins et la quantification fiable de leur complexité sont essentielles à la compréhension de la biologie et de la maladie du réseau vasculaire. Ici, nous fournissons une méthode détaillée pour visualiser les vaisseaux sanguins avec un colorant fluorescent disponible dans le commerce, un complexe DII-lipoprotéine à faible densité acétylée plasmatique humain (DiI-AcLDL) et à quantifier leur complexité chez Xenopus tropicalis . Les vaisseaux sanguins peuvent être étiquetés par une simple injection de DiI-AcLDL dans le coeur battant d'un embryon, et les vaisseaux sanguins dans l'ensemble de l'embryon peuvent être imagés dans des embryons vivants ou fixes. Combinée à la perturbation du gène par la micro-injection ciblée d'acides nucléiques et / ou l'application du bain de réactifs pharmacologiques, les rôles d'un gène ou d'une voie de signalisation sur le développement vasculaire peuvent être inveStigmatisé dans une semaine sans recourir à des animaux génétiquement modifiés. En raison du système veineux bien défini de Xenopus et de son angiogenèse stéréotypée, la germination des vaisseaux préexistants, la complexité des vaisseaux peut être quantifiée efficacement après les expériences de perturbation. Ce protocole relativement simple devrait servir d'outil facilement accessible dans divers domaines de la recherche cardiovasculaire.
Introduction
La vasculogenèse, la formation de nouveaux vaisseaux sanguins provenant de cellules endothéliales nouvellement nées et l'angiogenèse, la formation de nouveaux vaisseaux à partir de vaisseaux préexistants sont deux processus distincts qui forment la vascularisation embryonnaire 1 . Toute dysrégulation dans ces processus entraîne diverses maladies cardiaques et anomalies structurelles des vaisseaux. En outre, la croissance tumorale est associée à une croissance non surveillée des vaisseaux. En tant que tel, les mécanismes moléculaires sous-jacents à la vasculogenèse et à l'angiogenèse font l'objet d'une enquête intense 2 .
Xenopus et le poisson zèbre sont des modèles attrayants de vertébrés pour les études de vasculogenèse et d'angiogenèse, pour plusieurs raisons. Premièrement, leurs embryons sont petits; Par conséquent, il est relativement facile d'imaginer l'ensemble du système vasculaire. Deuxièmement, le développement embryonnaire est rapide; Il ne faut que quelques jours pour développer l'ensemble du système vasculaire, période pendant laquelle le vasculisme en développement L'image peut être imagée. Troisièmement, les interventions génétiques et pharmacologiques avant et pendant la formation des vaisseaux sont faciles à réaliser, par exemple grâce à la micro-injection de nucléotides morpholino-antisens (MO) dans l'embryon en développement ou par l'application du bain de médicaments 3 , 4 , 5 .
L'avantage unique de Xenopus sur le poisson zèbre est que des manipulations embryologiques peuvent être effectuées car Xenopus suit des clivages holoblastiques stéréotypés et la carte du sort embryonnaire est bien définie 6 . Par exemple, il est possible de générer un embryon dans lequel un seul côté latéral est manipulé génétiquement en injectant un MO antisens à une cellule au stade à deux cellules. Il est également possible de transplanter le primordium cardiaque d'un embryon à un autre pour déterminer si le gène exerce sa fonction par un mécanisme cellulaire intrinsèque ou extrinsèqueAss = "xref"> 7. Bien que ces techniques aient surtout été développées chez Xenopus laevis , qui est allotetraploïde et n'est donc pas idéale pour les études génétiques, elles peuvent être directement appliquées à Xenopus tropicalis , une espèce diploïde étroitement liée 8 .
Une façon de visualiser le système vasculaire dans un embryon Xenopus vivant consiste à injecter un colorant fluorescent pour étiqueter les vaisseaux sanguins. La lipoprotéine de basse densité acétylée (AcLDL) marquée avec une molécule fluorescente telle que DiI est une sonde très utile. Contrairement aux LDL non acétylées, les LDL ne se lient pas au récepteur LDL 9 mais sont endocytées par les macrophages et les cellules endothéliales. L'injection de DiI-AcLDL dans le cœur d'un animal vivant entraîne l'étiquetage spécifique des cellules endothéliales par fluorescence et toute la vascularisation peut être imagée par microscopie fluorescente dans des embryons vivants ou fixes 4 .
Ici, nous présDes protocoles détaillés pour la visualisation et la quantification des vaisseaux sanguins utilisant DiI-AcLDL dans Xenopus tropicalis ( figure 1 ). Nous fournissons des points pratiques clés, avec des exemples d'expériences réussies et infructueuses. En outre, nous fournissons une méthode simple pour l'analyse quantitative de la complexité vasculaire, ce qui pourrait être utile pour évaluer les effets des facteurs génétiques et environnementaux sur la mise en forme du réseau vasculaire.
Protocol
Representative Results
Discussion
Le protocole présenté ici a d'abord été développé par Ali H. Brivanlou et ses collègues pour enquêter sur les événements de développement lors de la formation vasculaire dans Xenopus laevis 4 , mais, comme le montre ce manuscrit, il peut être appliqué à d'autres petits animaux. L'injection de teinture dans le cœur est simple à réaliser, et l'ensemble du réseau vasculaire peut être imagé sous un microscope à dissection de fluorescence, ainsi qu'un …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Cette étude a été inspirée par le travail de Levine et al. , Qui décrit cette méthode expérimentale et fournit une description complète du développement vasculaire chez Xenopus laevis. Nous remercions les membres de notre laboratoire pour leur contribution. Cette étude a été soutenue par l'Initiative de recherche de l'Université de Yonsei en 2015 (2015-22-0095) et le Programme de développement de la technologie biologique et médicale de la Fondation nationale de la recherche (NRF) financé par le ministère des Sciences, des TIC et de la planification future ( NRF-2013M3A9D5072551)
Materials
| 35mm Petri dish | SPL | 10035 | Sylgard mold frame |
| 60mm Petri dish | SPL | 10060 | Embryo raising tray |
| Borosilicate Glass | Sutter instrument | B100-50-10 | Needle for injection |
| BSA | Sigma | A3059-10G | Coating reagent |
| CaCl2 | D.S.P.GR Reagent | 0.1X MBS component | |
| Coverslip | Superior | HSU-0111520 | For confocal imaging |
| DiI-AcLDL | Thermo Fisher Scientific | L3484 | Vessel staining solution |
| FBS | Hyclone | SH.30919.02 | For storage of testis |
| Fiber Optical Illuminator | World Precision Instruments | Z-LITE-Z | Light |
| Ficoll | Sigma | F4375 | Injection buffer |
| Flaming/Brown Micropipette Puller | Sutter instrument | P-97 | Injection needle puller |
| Forcep | Fine Science Tool | 11255-20 | For embryo hatching and needle tip cutting |
| Glass Bottom dish | SPL | 100350 | For confocal imaging |
| hCG | MNS Korea | For priming of frogs | |
| HEPES | Sigma | H3375 | Buffering agent |
| Incubator | Lab. Companion | ILP-02 | For raising embryos |
| KCl | DAEJUNG | 6566-4400 | MBS component |
| L15 medium | Gibco | 11415-114 | For storage of testis |
| L-cysteine | Sigma | 168149-100G | De-jellying reagent |
| MgSO4 | Sigma | M7506 | MBS component |
| Microtube | Axygen | MCT-175-C-S | For storage of testis |
| MS222 | Sigma | E10521 | Anesthetic powder |
| NaCl | DAEJUNG | 7647-14-5 | MBS component |
| NaOH | Sigma | S-0899 | pH adjusting reagent |
| Paraformaldehyde | Sigma | P6148 | Fixatives |
| PBS | BIOSESANG | P2007 | Buffer for imaging |
| pH paper | Sigma | P4536-100EA | For confirming pH |
| PICO-LITER INJECTOR | Waner instruments | PLI-100A | For injection |
| Pin | Pinservice | 26002-10 | For incision |
| Pinholder | Scitech Korea | 26016-12 | For incision |
| Precision Stereo Zoom Binocular Microscope | World Precision Instruments | PZMIII | For visual screening |
| Standard Manual Control Micromanipulator | Waner instruments | W4 64-0056 | For microinjection |
| SYLGARD 184 Kit | Dow Corning | For DiI injection | |
| Transfer pipette | Korea Ace Scientific Co. | YM.B78-400 | For eggs and embryo collection |
References
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