Summary

の胚性血管新生の可視化と定量分析<em>ツメガエル</em

Published: May 25, 2017
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Summary

このプロトコルは、脈管構造を視覚化し、 Xenopus tropicalisにおけるその複雑性を定量化する蛍光ベースの方法を実証する。インビボでの心臓血管発達を研究するために、遺伝的および/または薬理学的操作の後、胚の拍動する心臓に蛍光色素を注入した後、数分後に血管を撮像することができる。

Abstract

血管は酸素と栄養を体全体に供給し、脈管網の形成は緊密な発生制御下にある。血管の効率的なインビボ視覚化およびそれらの複雑さの確実な定量化は、血管ネットワークの生物学および疾患を理解する上で重要である。ここでは、市販の蛍光色素、ヒト血漿アセチル化低密度リポタンパク質DiI複合体(DiI-AcLDL)を用いて血管を可視化し、 アフリカツメガエルのトロピカリスにおける複雑性を定量化する詳細な方法を提供する。血管は、DiI-AcLDLを拍動する胚の心臓に簡単に注入することによって標識することができ、胚全体の血管を生きている胚または固定された胚に画像化することができる。核酸の標的とされたマイクロインジェクションによる遺伝子摂動および/または薬理学的試薬のバス適用と組み合わせて、血管発生における遺伝子またはシグナル伝達経路の役割は、洗練された遺伝子組み換え動物に頼らずに1週間以内に徴候を起こしました。 Xenopusの明確な静脈系およびその定型血管形成、既存の血管の発芽のために、血管の複雑さは、摂動実験後に効率的に定量化することができる。この比較的簡単なプロトコールは、心臓血管研究の様々な分野において容易にアクセス可能なツールとして役立つはずである。

Introduction

脈管形成、新しく生まれた内皮細胞からの新しい血管の形成、および血管新生(既存の血管か​​らの新しい血管の形成)は、胚性血管系を形成する2つの異なるプロセスである。これらのプロセスにおける調節不全は、様々な心疾患および血管の構造異常をもたらす。さらに、腫瘍の増殖は、制御されていない血管の成長と関連している。このように、脈管形成および血管新生の根底にある分子メカニズムは、激しい研究2の対象である。

アフリカツメガエルおよびゼブラフィッシュは、いくつかの理由から、脈管形成および血管形成研究のための魅力的な脊椎動物モデルである。まず、彼らの胚は小さいです。したがって、脈管構造全体を画像化することは比較的容易である。第二に、胚発生は急速である。脈管構造全体が発達するには数日しかかかりませんが、その間に発達中の血管画像を撮影することができる。第3に、血管形成の前および間における遺伝子および薬理学的介入は、アンチセンスモルホリノヌクレオチド(MO)の発達中の胚へのマイクロインジェクションまたは薬物3、4,5の浴適用などの実施が容易である。

ゼブラフィッシュに対するXenopusのユニークな利点は、 アフリカツメガエルがステレオタイプの巨胞性切断に続き、胚の運命マップが明確に定義されているため、発生学的操作を行うことができることです。例えば、アンチセンスMOを2細胞段階で1つの細胞に注入することによって、1つの側面のみが遺伝子操作される胚を作製することが可能である。心臓原基をある胚から別の胚へ移植することも可能であり、遺伝子が細胞内因性または胸腺内機構によってその機能を発揮するかどうかを決定することが可能であるass = "xref"> 7。これらの技術は、ほとんどがアロトプラドイドであり、したがって遺伝学的研究には理想的ではないアフリカツメガエル(Xenopus laevis)で開発されてきたが、密接に関連する二倍体種であるアフリカツメガエル熱帯魚に直接適用することができる8

生きているアフリカツメガエル胚の脈管構造を可視化する1つの方法は、血管に標識するために蛍光色素を注入することである。 DiIのような蛍光分子で標識したアセチル化低密度リポタンパク質(AcLDL)は非常に有用なプローブである。非アセチル化LDLとは異なり、AcLDLはLDL受容体9に結合しないが、マクロファージおよび内皮細胞によってエンドサイトーシスされる。生きている動物の心臓にDiI-AcLDLを注入すると、内皮細胞の特異的な蛍光標識が得られ、脈管構造全体を生きている胚または固定された胚の蛍光顕微鏡で画像化することができる4

ここでは、Xenopus tropicalisの DiI-AcLDLを用いた血管の可視化と定量の詳細なプロトコール( 図1 )。成功した実験と成功しなかった実験の例を中心に実践的なポイントを提供します。さらに、我々は、血管網の形成に及ぼす遺伝的および環境的要因の影響を評価するのに有用であり得る、血管複雑性の定量分析のための直接的な方法を提供する。

Protocol

すべての実験は、延世大学医学系機関の動物用ケアおよび使用委員会によって承認されたプロトコールを遵守した。 1. ツメガエルトロピカリス胚の調製 注: アフリカツメガエルトロピカリス胚は、わずかに改変して、以前に記載されたようにして産生された。 Xenopus tropicalisの胚は、NieuwkoopおよびFaber 11の表に従って飼育…

Representative Results

実験のタイムライン(図1および2) 受精直後に、遺伝子発現を調節するために標的化されたマイクロインジェクションを行うことができる。例えば、内在性Tie2 mRNAの開始コドンに特異的に結合するアンチセンスMOを注入することができ、立体障害によるTie2標的mRNAの翻訳を阻害する。 MOは、うまく注入された胚の容易な視覚?…

Discussion

ここに提示されたプロトコールは、 Xenopus laevis 4における血管形成中の発生事象を調査するためにAli H. Brivanlouらによって最初に開発されたが、この原稿に示されているように、他の小動物にも適用できる。心臓への色素注入は実行するのが簡単であり、血管ネットワーク全体を共焦点顕微鏡と同様に蛍光解剖顕微鏡下で画像化することができる。血管の発達中に色素?…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

この研究は、 Levine et al。これは、この実験方法を記載し、 アフリカツメガエルの血管発生の包括的な説明を提供した私たちは研究室のメンバーに感謝の意を表します。この研究は、2015年(2015-22- 0095)の将来的な研究イニシアチブと科学、ICT&未来計画の資金提供を受けて国立研究財団(NRF)のバイオ&医療技術開発プログラムNRF-2013M3A9D5072551)

Materials

35mm Petri dish SPL 10035 Sylgard mold frame
60mm Petri dish SPL 10060 Embryo raising tray
Borosilicate Glass Sutter instrument B100-50-10 Needle for injection
BSA Sigma A3059-10G Coating reagent
CaCl2 D.S.P.GR Reagent 0.1X MBS component
Coverslip Superior HSU-0111520 For confocal imaging
DiI-AcLDL Thermo Fisher Scientific L3484 Vessel staining solution
FBS Hyclone SH.30919.02 For storage of testis
Fiber Optical Illuminator World Precision Instruments Z-LITE-Z Light
Ficoll Sigma F4375 Injection buffer
Flaming/Brown Micropipette Puller Sutter instrument P-97 Injection needle puller
Forcep Fine Science Tool 11255-20 For embryo hatching and
needle tip cutting
Glass Bottom dish SPL 100350 For confocal imaging
hCG MNS Korea For priming of frogs
HEPES Sigma H3375 Buffering agent
Incubator Lab. Companion ILP-02 For raising embryos
KCl DAEJUNG 6566-4400 MBS component
L15 medium Gibco 11415-114 For storage of testis
L-cysteine Sigma 168149-100G De-jellying reagent
MgSO4 Sigma M7506 MBS component
Microtube Axygen MCT-175-C-S For storage of testis
MS222 Sigma E10521 Anesthetic powder
NaCl DAEJUNG 7647-14-5 MBS component
NaOH Sigma S-0899 pH adjusting reagent
Paraformaldehyde Sigma P6148 Fixatives
PBS BIOSESANG P2007 Buffer for imaging
pH paper Sigma P4536-100EA For confirming pH
PICO-LITER INJECTOR Waner instruments PLI-100A For injection
Pin Pinservice 26002-10 For incision
Pinholder Scitech Korea 26016-12 For incision
Precision Stereo Zoom Binocular Microscope World Precision Instruments PZMIII For visual screening
Standard Manual Control Micromanipulator  Waner instruments W4 64-0056 For microinjection
SYLGARD 184 Kit Dow Corning For DiI injection
Transfer pipette Korea Ace Scientific Co. YM.B78-400 For eggs and
embryo collection

References

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Cite This Article
Ohk, J., Jung, H. Visualization and Quantitative Analysis of Embryonic Angiogenesis in Xenopus tropicalis. J. Vis. Exp. (123), e55652, doi:10.3791/55652 (2017).

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