التصور والتحليل الكمي من الأوعية الدموية الجنينية في<em> زينوبوس تروبيكاليس</em
Summary
يوضح هذا البروتوكول طريقة القائم على مضان لتصور الأوعية الدموية وتحديد مدى تعقيدها في القيطم الاستوائية . الأوعية الدموية يمكن تصويرها بعد دقائق من حقن صبغة الفلورسنت في قلب الضرب من الجنين بعد التلاعب الجيني و / أو الدوائية لدراسة التنمية القلب والأوعية الدموية في الجسم الحي .
Abstract
الأوعية الدموية توريد الأكسجين والمواد المغذية في جميع أنحاء الجسم، وتشكيل شبكة الأوعية الدموية تحت السيطرة التنموية الضيقة. كفاءة في التصور الجسم الحي من الأوعية الدموية وكمية موثوق بها من تعقيدها هي المفتاح لفهم البيولوجيا والمرض للشبكة الوعائية. هنا، ونحن نقدم طريقة مفصلة لتصور الأوعية الدموية مع صبغ الفلورسنت المتاحة تجاريا، والبلازما البشرية أسيتيلات منخفضة الكثافة البروتين الدهني مجمع الجاذبة (ديي أكلدل)، وتحديد مدى تعقيدها في القيطم الاستوائية . يمكن وصف الأوعية الدموية عن طريق حقن بسيط من الجاذبة- أكلدل في قلب الضرب من الجنين، والأوعية الدموية في الجنين بأكمله يمكن تصويرها في الأجنة الحية أو الثابتة. جنبا إلى جنب مع اضطراب الجينات من قبل ميكروينجكتيون المستهدفة من الأحماض النووية و / أو تطبيق حمام الكواشف الدوائية، وأدوار الجين أو مسار الإشارات على التنمية الأوعية الدموية يمكن أن يكونفي غضون أسبوع واحد دون اللجوء إلى الحيوانات المتطورة وراثيا. بسبب النظام الوريدي المعرفة جيدا من القيطم وتوليد الأوعية النمطية، تنبت من السفن الموجودة من قبل، يمكن أن يكون كميا تعقيد السفينة بكمية بكفاءة بعد التجارب الاضطراب. وينبغي أن يكون هذا البروتوكول بسيط نسبيا بمثابة أداة يمكن الوصول إليها بسهولة في مجالات متنوعة من البحوث القلب والأوعية الدموية.
Introduction
تشكيل الأوعية الدموية، وتشكيل الأوعية الدموية الجديدة من الخلايا البطانية المولودة حديثا، والأوعية الدموية، وتشكيل سفن جديدة من السفن الموجودة من قبل، هي عمليتين متميزة التي تشكل الأوعية الدموية الجنينية 1 . أي اختلال في هذه العمليات يؤدي إلى أمراض القلب المختلفة والتشوهات الهيكلية للسفن. وعلاوة على ذلك، يرتبط نمو الورم مع نمو السفن غير المنضبط. على هذا النحو، والآليات الجزيئية الكامنة وراء الأوعية الدموية والأوعية الدموية هي موضوع تحقيق مكثف 2 .
القيطم والزرد هي نماذج جذابة الفقاريات لدراسات الأوعية الدموية ودراسات الأوعية الدموية، لعدة أسباب. أولا، أجنة صغيرة. وبالتالي، فمن السهل نسبيا لصورة الأوعية الدموية بأكملها. ثانيا، التطور الجنيني هو سريع. يستغرق سوى بضعة أيام ل الأوعية الدموية بأكملها لتطوير، وخلال ذلك الوقت الأوعية الدموية النامية أتيور يمكن تصويرها. ثالثا، التدخلات الجينية والدوائية قبل وأثناء تشكيل السفن هي سهلة لأداء، مثل من خلال ميكروينجكتيون من النيوكليوتيدات مورفولينو مضادات (موس) في الجنين النامي أو من خلال تطبيق حمام من المخدرات 3 ، 4 ، 5 .
ميزة فريدة من القيطم على الزرد هو أن التلاعب الجنينية لا يمكن أن يؤديها لأن القيطم يتبع الانقسامات هوليوبلاستيك النمطية وخريطة مصير الجنينية محددة جيدا 6 . على سبيل المثال، فمن الممكن لتوليد الجنين حيث يتم التلاعب الجانب الجانبي واحد فقط عن طريق حقن مو موتزين إلى خلية واحدة في مرحلة اثنين من الخلايا. ومن الممكن أيضا لزرع القلب الأولي من جنين إلى آخر لتحديد ما إذا كان الجين يمارس وظيفته من خلال خلية جوهرية أو آلية -extrinsicأس = "كريف"> 7. على الرغم من أن هذه التقنيات قد وضعت في الغالب في القيطم ليفيس، وهو ألوتيترابلويد، وبالتالي ليست مثالية للدراسات الوراثية، ويمكن تطبيقها مباشرة على الزينوبوس تروبيكاليس ، وهو نوع من الأنواع ثنائية الارتباط وثيقة الصلة 8 .
طريقة واحدة لتصور الأوعية الدموية في جنين القرد الحية هو حقن صبغة الفلورسنت لتسمية الأوعية الدموية. أسيتيلد البروتين الدهني منخفض الكثافة (أكلدل) المسمى مع جزيء الفلورسنت مثل الجاذبة هو مسبار مفيد جدا. على عكس لدل أونستيتيلاتد، أكلدل لا يرتبط لمستقبلات لدل 9 ولكن إندوسيتوسد بواسطة الضامة والخلايا البطانية. حقن داي-أكلدل في قلب نتائج الحيوانات الحية في وضع العلامات الفلورسنت محددة من الخلايا البطانية، ويمكن تصوير الأوعية الدموية بأكملها من قبل المجهر مضان في الأجنة الحية أو الثابتة 4 .
هنا، نحن بريسفي بروتوكولات مفصلة لتصور وتقدير الكميات من الأوعية الدموية باستخدام دالي-أكلدل في القيطم تروبيكاليس ( الشكل 1 ). نحن نقدم نقاط عملية رئيسية، مع أمثلة من التجارب الناجحة وغير الناجحة. وبالإضافة إلى ذلك، ونحن نقدم طريقة واضحة للتحليل الكمي للتعقيد الأوعية الدموية، والتي قد تكون مفيدة في تقييم آثار العوامل الوراثية والبيئية على تشكيل شبكة الأوعية الدموية.
Protocol
Representative Results
Discussion
بروتوكول المقدمة هنا وضعت لأول مرة من قبل علي H. بريفنلو وزملائه للتحقيق في الأحداث التنموية خلال تشكيل الأوعية الدموية في القيطم ليفيس 4 ، ولكن، كما هو مبين في هذه المخطوطة، فإنه يمكن تطبيقها على الحيوانات الصغيرة الأخرى. صبغ الحقن في القلب هو بسيط ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
وقد استلهمت هذه الدراسة من عمل ليفين وآخرون. ، الذي وصف هذه الطريقة التجريبية وقدم وصفا شاملا للتنمية الأوعية الدموية في القيطم ليفيس . نشكر أعضاء مختبرنا على مدخلاتهم. وقد تم دعم هذه الدراسة من قبل مبادرة البحوث الرائدة في المستقبل جامعة يونسي 2015 (2015-22- 0095) وبرنامج تطوير التكنولوجيا الحيوية والتكنولوجيا الطبية للمؤسسة الوطنية للبحوث (نرف) بتمويل من وزارة العلوم وتكنولوجيا المعلومات والاتصالات والتخطيط المستقبلي ( جبهة الخلاص الوطني، 2013M3A9D5072551)
Materials
| 35mm Petri dish | SPL | 10035 | Sylgard mold frame |
| 60mm Petri dish | SPL | 10060 | Embryo raising tray |
| Borosilicate Glass | Sutter instrument | B100-50-10 | Needle for injection |
| BSA | Sigma | A3059-10G | Coating reagent |
| CaCl2 | D.S.P.GR Reagent | 0.1X MBS component | |
| Coverslip | Superior | HSU-0111520 | For confocal imaging |
| DiI-AcLDL | Thermo Fisher Scientific | L3484 | Vessel staining solution |
| FBS | Hyclone | SH.30919.02 | For storage of testis |
| Fiber Optical Illuminator | World Precision Instruments | Z-LITE-Z | Light |
| Ficoll | Sigma | F4375 | Injection buffer |
| Flaming/Brown Micropipette Puller | Sutter instrument | P-97 | Injection needle puller |
| Forcep | Fine Science Tool | 11255-20 | For embryo hatching and needle tip cutting |
| Glass Bottom dish | SPL | 100350 | For confocal imaging |
| hCG | MNS Korea | For priming of frogs | |
| HEPES | Sigma | H3375 | Buffering agent |
| Incubator | Lab. Companion | ILP-02 | For raising embryos |
| KCl | DAEJUNG | 6566-4400 | MBS component |
| L15 medium | Gibco | 11415-114 | For storage of testis |
| L-cysteine | Sigma | 168149-100G | De-jellying reagent |
| MgSO4 | Sigma | M7506 | MBS component |
| Microtube | Axygen | MCT-175-C-S | For storage of testis |
| MS222 | Sigma | E10521 | Anesthetic powder |
| NaCl | DAEJUNG | 7647-14-5 | MBS component |
| NaOH | Sigma | S-0899 | pH adjusting reagent |
| Paraformaldehyde | Sigma | P6148 | Fixatives |
| PBS | BIOSESANG | P2007 | Buffer for imaging |
| pH paper | Sigma | P4536-100EA | For confirming pH |
| PICO-LITER INJECTOR | Waner instruments | PLI-100A | For injection |
| Pin | Pinservice | 26002-10 | For incision |
| Pinholder | Scitech Korea | 26016-12 | For incision |
| Precision Stereo Zoom Binocular Microscope | World Precision Instruments | PZMIII | For visual screening |
| Standard Manual Control Micromanipulator | Waner instruments | W4 64-0056 | For microinjection |
| SYLGARD 184 Kit | Dow Corning | For DiI injection | |
| Transfer pipette | Korea Ace Scientific Co. | YM.B78-400 | For eggs and embryo collection |
References
- Herbert, S. P., Stainier, D. Y. Molecular control of endothelial cell behaviour during blood vessel morphogenesis. Nat Rev Mol Cell Biol. 12 (9), 551-564 (2011).
- Augustin, H. G., Koh, G. Y., Thurston, G., Alitalo, K. Control of vascular morphogenesis and homeostasis through the angiopoietin-Tie system. Nat Rev Mol Cell Biol. 10 (3), 165-177 (2009).
- Lawson, N. D., Weinstein, B. M. Arteries and veins: making a difference with zebrafish. Nat Rev Genet. 3 (9), 674-682 (2002).
- Levine, A. J., Munoz-Sanjuan, I., Bell, E., North, A. J., Brivanlou, A. H. Fluorescent labeling of endothelial cells allows in vivo, continuous characterization of the vascular development of Xenopus laevis. Dev Biol. 254 (1), 50-67 (2003).
- Yang, C., et al. Calmodulin Mediates Ca2+-Dependent Inhibition of Tie2 Signaling and Acts as a Developmental Brake During Embryonic Angiogenesis. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 36 (7), 1406-1416 (2016).
- Moody, S. A. Fates of the blastomeres of the 32-cell-stage Xenopus embryo. Dev Biol. 122 (2), 300-319 (1987).
- Elliott, K. L., Houston, D. W., Fritzsch, B. Transplantation of Xenopus laevis tissues to determine the ability of motor neurons to acquire a novel target. PLoS One. 8 (2), 55541 (2013).
- Grainger, R. M. Xenopus tropicalis as a model organism for genetics and genomics: past, present, and future. Methods Mol Biol. 917, 3-15 (2012).
- Weisgraber, K. H., Innerarity, T. L., Mahley, R. W. Role of lysine residues of plasma lipoproteins in high affinity binding to cell surface receptors on human fibroblasts. J Biol Chem. 253 (24), 9053-9062 (1978).
- Showell, C., Conlon, F. L. Egg collection and in vitro fertilization of the western clawed frog Xenopus tropicalis. Cold Spring Harb Protoc. 2009 (9), 5293 (2009).
- Nieuwkoop, P. D., Faber, J. . Normal Table of Xenopus laevis (Daudin). , (1956).
- Longair, M. H., Baker, D. A., Armstrong, J. D. Simple Neurite Tracer: open source software for reconstruction, visualization and analysis of neuronal processes. Bioinformatics. 27 (17), 2453-2454 (2011).
- Marshak, S., Nikolakopoulou, A. M., Dirks, R., Martens, G. J., Cohen-Cory, S. Cell-autonomous TrkB signaling in presynaptic retinal ganglion cells mediates axon arbor growth and synapse maturation during the establishment of retinotectal synaptic connectivity. J Neurosci. 27 (10), 2444-2456 (2007).
- Cha, H. J., et al. Evolutionarily repurposed networks reveal the well-known antifungal drug thiabendazole to be a novel vascular disrupting agent. PLoS Biol. 10 (8), 1001379 (2012).
- Ny, A., et al. A transgenic Xenopus laevis reporter model to study lymphangiogenesis. Biol Open. 2 (9), 882-890 (2013).
- Bussmann, J., et al. Arteries provide essential guidance cues for lymphatic endothelial cells in the zebrafish trunk. Development. 137 (16), 2653-2657 (2010).
- Li, X. M., Hu, Z., Jorgenson, M. L., Slayton, W. B. High levels of acetylated low-density lipoprotein uptake and low tyrosine kinase with immunoglobulin and epidermal growth factor homology domains-2 (Tie2) promoter activity distinguish sinusoids from other vessel types in murine bone marrow. Circulation. 120 (19), 1910-1918 (2009).
