Visualisierung und quantitative Analyse der embryonalen Angiogenese in<em> Xenopus tropicalis</em
Summary
Dieses Protokoll zeigt eine fluoreszenzbasierte Methode zur Visualisierung der Vaskulatur und zur Quantifizierung ihrer Komplexität in Xenopus tropicalis . Blutgefäße können nach der Injektion eines fluoreszierenden Farbstoffs in das schlagende Herz eines Embryos nach genetischen und / oder pharmakologischen Manipulationen abgebildet werden, um die kardiovaskuläre Entwicklung in vivo zu untersuchen.
Abstract
Blutgefäße liefern Sauerstoff und Nährstoffe im ganzen Körper, und die Bildung des Gefäßnetzes ist unter engen Entwicklungskontrolle. Die effiziente In-vivo- Visualisierung von Blutgefäßen und die zuverlässige Quantifizierung ihrer Komplexität sind der Schlüssel zum Verständnis der Biologie und der Erkrankung des Gefäßnetzes. Hier stellen wir eine detaillierte Methode zur Verfügung, um Blutgefäße mit einem handelsüblichen Fluoreszenzfarbstoff, einem humanen Plasma acetylierten Diiplex (DiI-AcLDL) mit niedriger Dichte zu identifizieren und ihre Komplexität in Xenopus tropicalis zu quantifizieren . Blutgefäße können durch eine einfache Injektion von DiI-AcLDL in das schlagende Herz eines Embryos markiert werden, und Blutgefäße im gesamten Embryo können in lebenden oder fixierten Embryonen abgebildet werden. Kombiniert mit der Genstörung durch die gezielte Mikroinjektion von Nukleinsäuren und / oder die Badanwendung von pharmakologischen Reagenzien können die Rollen eines Gens oder eines Signalweges auf der Gefäßentwicklung auftretenStammte innerhalb einer Woche ohne Rückgriff auf anspruchsvolle gentechnisch veränderte Tiere. Wegen des wohldefinierten venösen Systems von Xenopus und seiner stereotypen Angiogenese kann das Keimen von bereits vorhandenen Gefäßen die Gefäßkomplexität nach Störungsexperimenten effizient quantifiziert werden. Dieses relativ einfache Protokoll sollte als ein leicht zugängliches Werkzeug in verschiedenen Bereichen der Herz-Kreislauf-Forschung dienen.
Introduction
Die Vaskulogenese, die Bildung neuer Blutgefäße aus neugeborenen Endothelzellen und die Angiogenese, die Bildung neuer Gefäße aus bereits vorhandenen Gefäßen, sind zwei verschiedene Prozesse, die das embryonale Gefäßbild verändern. Jede Dysregulation in diesen Prozessen führt zu verschiedenen Herzerkrankungen und strukturellen Anomalien der Gefäße. Darüber hinaus ist das Tumorwachstum mit dem unkontrollierten Gefäßwachstum verbunden. Als solche sind molekulare Mechanismen, die der Vaskulogenese und der Angiogenese zugrunde liegen, Gegenstand intensiver Untersuchungen 2 .
Xenopus und Zebrafisch sind aus verschiedenen Gründen attraktive Wirbeltiermodelle für Vaskulogenese- und Angiogenese-Studien. Zuerst sind ihre Embryos klein; Daher ist es relativ einfach, die gesamte vaskulatur zu bildlich zu machen. Zweitens ist die embryonale Entwicklung schnell; Es dauert nur ein paar tage für das gesamte vasculature zu entwickeln, während welcher zeit das entwickelnde vaskul Ature kann abgebildet werden. Drittens sind genetische und pharmakologische Interventionen vor und während der Gefäßbildung leicht durchzuführen, wie durch die Mikroinjektion von Antisense-Morpholino-Nukleotiden (MOs) in den sich entwickelnden Embryo oder durch die Badanwendung der Medikamente 3 , 4 , 5 .
Der einmalige Vorteil von Xenopus über Zebrafisch ist, dass embryologische Manipulationen durchgeführt werden können, weil Xenopus stereotypen holoblastischen Spaltungen folgt und die embryonale Schicksalskarte gut definiert ist 6 . Beispielsweise ist es möglich, einen Embryo zu erzeugen, bei dem nur eine laterale Seite genetisch manipuliert wird, indem man ein Antisense-MO zu einer Zelle im Zweizellenstadium injiziert. Es ist auch möglich, das Herz-Primordium von einem Embryo zu einem anderen zu transplantieren, um zu bestimmen, ob das Gen seine Funktion durch einen zell-intrinsischen oder -extrinsischen Mechanismus ausübtAss = "xref"> 7 Obwohl diese Techniken meist in Xenopus laevis entwickelt wurden, das allotetraploid ist und daher nicht ideal für genetische Studien ist, können sie direkt auf Xenopus tropicalis angewendet werden , eine eng verwandte diploide Spezies 8 .
Eine Möglichkeit, die Vaskulatur in einem lebenden Xenopus- Embryo zu visualisieren, besteht darin, einen Fluoreszenzfarbstoff zu injizieren, um die Blutgefäße zu etikettieren. Acetyliertes Lipoprotein mit niedriger Dichte (AcLDL), das mit einem fluoreszierenden Molekül wie DiI markiert ist, ist eine sehr nützliche Sonde. Im Gegensatz zu nichtacetyliertem LDL bindet AcLDL nicht an den LDL-Rezeptor 9, sondern wird durch Makrophagen und Endothelzellen endozytiert. Die Injektion von DiI-AcLDL in das Herz eines lebenden Tieres führt zu einer spezifischen fluoreszierenden Markierung von Endothelzellen, und das gesamte Gefäßsystem kann durch Fluoreszenzmikroskopie in lebenden oder fixierten Embryonen abgebildet werden 4 .
Hier haben wir vorDetaillierte Protokolle für die Visualisierung und Quantifizierung von Blutgefäßen mit DiI-AcLDL in Xenopus tropicalis ( Abbildung 1 ). Wir bieten wichtige praktische Punkte, mit Beispielen für erfolgreiche und erfolglose Experimente. Darüber hinaus bieten wir eine einfache Methode zur quantitativen Analyse der vaskulären Komplexität, die bei der Beurteilung der Auswirkungen von genetischen und umweltbedingten Faktoren auf die Formgebung des Gefäßnetzes nützlich sein könnte.
Protocol
Representative Results
Discussion
Das hier vorgestellte Protokoll wurde zuerst von Ali H. Brivanlou und Kollegen entwickelt, um Entwicklungsereignisse während der Gefäßbildung in Xenopus laevis 4 zu untersuchen, aber wie in diesem Manuskript gezeigt, kann es auf andere kleine Tiere angewendet werden. Die Farbinjektion in das Herz ist einfach durchzuführen, und das gesamte Gefäßnetzwerk kann unter einem Fluoreszenzdissektionsmikroskop sowie ein konfokales Mikroskop abgebildet werden. Wenn der Farbstoff während der …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Diese Studie wurde von der Arbeit von Levine et al. , Die diese experimentelle Methode beschrieben und eine umfassende Beschreibung der vaskulären Entwicklung in Xenopus laevis zur Verfügung stellte . Wir danken den Mitgliedern unseres Labors für ihre Inputs. Diese Studie wurde von der Yonsei University Future-führenden Forschungsinitiative von 2015 (2015-22-0095) und dem Bio & Medical Technology Development Program der Nationalen Forschungsstiftung (NRF) unterstützt, die vom Ministerium für Wissenschaft, IKT & Zukunftsplanung ( NRF-2013M3A9D5072551)
Materials
| 35mm Petri dish | SPL | 10035 | Sylgard mold frame |
| 60mm Petri dish | SPL | 10060 | Embryo raising tray |
| Borosilicate Glass | Sutter instrument | B100-50-10 | Needle for injection |
| BSA | Sigma | A3059-10G | Coating reagent |
| CaCl2 | D.S.P.GR Reagent | 0.1X MBS component | |
| Coverslip | Superior | HSU-0111520 | For confocal imaging |
| DiI-AcLDL | Thermo Fisher Scientific | L3484 | Vessel staining solution |
| FBS | Hyclone | SH.30919.02 | For storage of testis |
| Fiber Optical Illuminator | World Precision Instruments | Z-LITE-Z | Light |
| Ficoll | Sigma | F4375 | Injection buffer |
| Flaming/Brown Micropipette Puller | Sutter instrument | P-97 | Injection needle puller |
| Forcep | Fine Science Tool | 11255-20 | For embryo hatching and needle tip cutting |
| Glass Bottom dish | SPL | 100350 | For confocal imaging |
| hCG | MNS Korea | For priming of frogs | |
| HEPES | Sigma | H3375 | Buffering agent |
| Incubator | Lab. Companion | ILP-02 | For raising embryos |
| KCl | DAEJUNG | 6566-4400 | MBS component |
| L15 medium | Gibco | 11415-114 | For storage of testis |
| L-cysteine | Sigma | 168149-100G | De-jellying reagent |
| MgSO4 | Sigma | M7506 | MBS component |
| Microtube | Axygen | MCT-175-C-S | For storage of testis |
| MS222 | Sigma | E10521 | Anesthetic powder |
| NaCl | DAEJUNG | 7647-14-5 | MBS component |
| NaOH | Sigma | S-0899 | pH adjusting reagent |
| Paraformaldehyde | Sigma | P6148 | Fixatives |
| PBS | BIOSESANG | P2007 | Buffer for imaging |
| pH paper | Sigma | P4536-100EA | For confirming pH |
| PICO-LITER INJECTOR | Waner instruments | PLI-100A | For injection |
| Pin | Pinservice | 26002-10 | For incision |
| Pinholder | Scitech Korea | 26016-12 | For incision |
| Precision Stereo Zoom Binocular Microscope | World Precision Instruments | PZMIII | For visual screening |
| Standard Manual Control Micromanipulator | Waner instruments | W4 64-0056 | For microinjection |
| SYLGARD 184 Kit | Dow Corning | For DiI injection | |
| Transfer pipette | Korea Ace Scientific Co. | YM.B78-400 | For eggs and embryo collection |
References
- Herbert, S. P., Stainier, D. Y. Molecular control of endothelial cell behaviour during blood vessel morphogenesis. Nat Rev Mol Cell Biol. 12 (9), 551-564 (2011).
- Augustin, H. G., Koh, G. Y., Thurston, G., Alitalo, K. Control of vascular morphogenesis and homeostasis through the angiopoietin-Tie system. Nat Rev Mol Cell Biol. 10 (3), 165-177 (2009).
- Lawson, N. D., Weinstein, B. M. Arteries and veins: making a difference with zebrafish. Nat Rev Genet. 3 (9), 674-682 (2002).
- Levine, A. J., Munoz-Sanjuan, I., Bell, E., North, A. J., Brivanlou, A. H. Fluorescent labeling of endothelial cells allows in vivo, continuous characterization of the vascular development of Xenopus laevis. Dev Biol. 254 (1), 50-67 (2003).
- Yang, C., et al. Calmodulin Mediates Ca2+-Dependent Inhibition of Tie2 Signaling and Acts as a Developmental Brake During Embryonic Angiogenesis. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 36 (7), 1406-1416 (2016).
- Moody, S. A. Fates of the blastomeres of the 32-cell-stage Xenopus embryo. Dev Biol. 122 (2), 300-319 (1987).
- Elliott, K. L., Houston, D. W., Fritzsch, B. Transplantation of Xenopus laevis tissues to determine the ability of motor neurons to acquire a novel target. PLoS One. 8 (2), 55541 (2013).
- Grainger, R. M. Xenopus tropicalis as a model organism for genetics and genomics: past, present, and future. Methods Mol Biol. 917, 3-15 (2012).
- Weisgraber, K. H., Innerarity, T. L., Mahley, R. W. Role of lysine residues of plasma lipoproteins in high affinity binding to cell surface receptors on human fibroblasts. J Biol Chem. 253 (24), 9053-9062 (1978).
- Showell, C., Conlon, F. L. Egg collection and in vitro fertilization of the western clawed frog Xenopus tropicalis. Cold Spring Harb Protoc. 2009 (9), 5293 (2009).
- Nieuwkoop, P. D., Faber, J. . Normal Table of Xenopus laevis (Daudin). , (1956).
- Longair, M. H., Baker, D. A., Armstrong, J. D. Simple Neurite Tracer: open source software for reconstruction, visualization and analysis of neuronal processes. Bioinformatics. 27 (17), 2453-2454 (2011).
- Marshak, S., Nikolakopoulou, A. M., Dirks, R., Martens, G. J., Cohen-Cory, S. Cell-autonomous TrkB signaling in presynaptic retinal ganglion cells mediates axon arbor growth and synapse maturation during the establishment of retinotectal synaptic connectivity. J Neurosci. 27 (10), 2444-2456 (2007).
- Cha, H. J., et al. Evolutionarily repurposed networks reveal the well-known antifungal drug thiabendazole to be a novel vascular disrupting agent. PLoS Biol. 10 (8), 1001379 (2012).
- Ny, A., et al. A transgenic Xenopus laevis reporter model to study lymphangiogenesis. Biol Open. 2 (9), 882-890 (2013).
- Bussmann, J., et al. Arteries provide essential guidance cues for lymphatic endothelial cells in the zebrafish trunk. Development. 137 (16), 2653-2657 (2010).
- Li, X. M., Hu, Z., Jorgenson, M. L., Slayton, W. B. High levels of acetylated low-density lipoprotein uptake and low tyrosine kinase with immunoglobulin and epidermal growth factor homology domains-2 (Tie2) promoter activity distinguish sinusoids from other vessel types in murine bone marrow. Circulation. 120 (19), 1910-1918 (2009).
