体外模擬微小重力下でのマウス前胞状卵胞の成長

この研究のための倫理的な承認は、動物研究倫理委員会の文周医学部から得られました。 1. 文化メディアとアルギン酸ヒドロゲルの準備 卵巣組織と 10% 牛胎児血清、100 IU/mL ペニシリン、100 μ g/mL ストレプトマイシンと L-15 媒体を用いた包取扱い媒体を準備します。2 週間 4 ° C で保存します。 卵巣組織とアルファ最小必須培 [α-MEM] 5% ウシ胎児血清 [FB] から成る卵胞培養培地準備 1% インシュリン-セレン-トランスフェリン、10 の美羽/ml rFSH、100 IU/mL ペニシリン、ストレプトマイシン 100 μ g/mL。2 週間 4 ° C で保存します。 滅菌 PBS で 0.8% (w/v) アルギン酸ナトリウム溶液を用いたアルギン酸ヒドロゲルを準備し、アルギン酸ビーズを作成するためのカプセル化ソリューション (140 mM NaCl 50 mM CaCl2) にこの溶液 10 μ L をドロップします。注: アルギン酸ビーズのサイズは、直径約 3 mm だった。 2. マウス卵胞分離とカプセル化 はさみや鉗子を使用して無菌削除卵巣子宮頸の転位で 14 日齢の icr 系雌マウスを処分、2 mL の処理中に卵巣を置きます。 卵巣をメスを使用して半分にカットします。半分の大きさの卵巣組織は培養培地における文化の厚さ約 1 mm だった 手動で 2-4 X 顕微鏡下 26 1/2 ゲージ針を使用して卵巣から卵胞を分離し、培養培地における文化の選択した卵胞を収集します。注: 卵胞選択基準: 1) 卵胞は中高 2 卵母細胞を取り巻く顆粒膜細胞の 2-3 層の卵母細胞のラウンドでした) 卵胞があったいくつかの卵胞膜細胞付けそのまま基底膜と 3) 卵胞のサイズは 90-100 μ m 手順 1.3 あたりアルギン酸ビーズを作成します。アルギン酸溶液で毛包を洗浄し、すべてのビーズに顕微鏡の下で単一卵胞が含まれているようにそれぞれのアルギン酸ビーズの真ん中に単一卵胞をピペットします。培地、文化、アルギン酸で培地 35 × 150 μ L にビーズを洗浄した後 10 mm 皿または RWV デバイスの文化. 3. 卵巣組織または模擬微小重力下で卵胞文化 模擬微小重力の生成に RWV デバイスを使用します。光パラフィン オイル (~ 10 mL) 容器を埋める、油に液滴の 150 μ L の培地を配置し、中の液滴に卵巣組織の 1 つの部分またはカプセル化された包 3 つアルギン酸ビーズを転送します。船ポート キャップを閉じ、デバイスの回転のベースの上に容器を修正します。 コントロールのグループ毛包を含むアルギン酸ビーズを配置または 10 mm 培養皿 35 × 光パラフィン油で覆われた液滴の培地の 150 μ L に卵巣の組織。 培養皿と 5% CO2空気中を 37 ° C で加湿のインキュベーターで RWV デバイスの両方を孵化させなさい。 RWV デバイスで培養液を変更する: 150 × 20 mm 培養皿にオイルと容器から媒体を注ぐ、卵巣の組織およびアルギン酸塩ビーズを培養液中で培養皿に転送します。ステップ 3.1 あたり容器文化システムを再確立します。 4. カプセル化解除と卵胞検索 培養 4 日後 150 × 20 mm 培養皿にオイルと容器から媒体を注ぐ。処理培 37 ° C で 30 分間 10 U/mL アルギン酸リアーゼの孵化によってアルギン酸ビーズとアルギン酸ビーズからカプセル化解除包を拾う 包を収集し、顕微鏡の下で媒体の処理でそれらを洗浄します。 5. 卵巣組織と卵胞評価 セル実行可能性の試金 D-PBS のカプセル化解除される卵胞を 3 回洗浄し、結合されたセル実行可能性の試金の試薬の 150 μ L の間孵化させなさいそれら (2 μ M カルセイン AM と 4 μ M EthD 1) 45 分間室温で。 10 きれいな顕微鏡スライドに卵胞を転送 μ L、D PBS、coverslip でカバーし、明確な指の爪マニキュアで封印します。 カウント グリーンと赤細胞を共焦点レーザー蛍光顕微鏡 (400 倍) でのスライドで。注: この実行可能性の試金で緑の細胞は生きているセルと赤の細胞は死んだ細胞です。未満 10% 赤血球 (死者) の卵胞は、生き残った卵胞としてと見なされます。 ヘマトキシリンとエオシン (H & E) 卵胞や卵巣組織の染色 新鮮な 14 日齢マウス卵巣と 0 日サンプルとして Bouin のソリューションで 14 日齢マウスから分離した前胞状卵胞を修正します。実験サンプルとして 2 日間または 4 日間のいずれかのカルチャ、およびアルギン酸ビーズの中の個々 の卵胞後 4 日間培養後の培養の卵巣組織を修復します。 パラフィン セクション 5 μ m の厚みで連続的にすべてのサンプルを埋め込むし、H で汚れ & 製造元の指示に従って E。 卵胞を数えると直径の測定 H に染まった卵巣切片で & E、すべての卵胞と顕微鏡 (倍率 400 X) 組織断面積内健康の前胞状卵胞を数えます。卵胞の総数によって前胞状卵胞の数を割ることによって卵胞の密度を計算します。注: 健康の前胞状卵胞顆粒膜細胞の少なくとも 2 つの層で、です。 包 0 日目と 4 日目のメジャー卵胞と卵母細胞径は培養卵胞です。 免疫組織化学 4% のパラホルムアルデヒドの卵巣組織を修正、パラフィン、5 μ m 厚のセクションに埋め込むし、スライドの台紙はティッシュ セクション。Dewax セクション、水分補給と 15 分ブロック用クエン酸バッファーのそれらの 3% 過酸化水素で内因性ペルオキシダーゼを孵化させなさい、5% ヤギ血清内の抗原の正体を暴露し、3 時間室温で一次抗体とインキュベートします。 3 分間、PBS で洗浄し、希釈 1: 500 西洋ワサビペルオキシダーゼ (HRP) のスライド-共役ヤギ抗ウサギ IgG (H + L) 室温で 1 時間。注: 一次抗体の研究に使用されたウサギ抗 GDF 9 抗体 (1: 500 希釈) とウサギ抗 PCNA 抗体 (希釈 1: 200)。 メディアを水性マウントをスライド ガラスに 3, 3′-ジアミノベンジジン パーオキシダーゼ活性とマウントを検出する [軽打] 卵巣セクション スライドを孵化させなさい。 400 倍の倍率での顕微鏡下で卵巣のセクションのスライドを確認します。 透過型電子顕微鏡 [TEM] 室温で 3 h の 2.5% グルタルアルデヒドで卵胞を修正し、37 ° C で 1 時間 1% オスミウム四酸化で修正後PBS で洗浄し、37 ° C で 1% リンタングステン酸と 1 時間 1% ナトリウム 005. 卵胞を扱う脱水アセトン シリーズを使用して卵胞: 25、50、75、95 と 100% (3 回)、および、最終的に 100% アセトン後エポキシ樹脂-アセトン混合物 37 ° C でステップし、エポキシ樹脂 45 ° C で埋め込む 1.0 μ m 半薄いセクションに埋め込まれたブロックをカットし、ブロック化で卵胞をローカライズするのには 1-2 分の 1% メチレン ブルーのセクションを染色します。50 nm 超薄切片に埋め込まれたブロックをカットし、透過電子顕微鏡用グリッドのセクションをマウントします。 6. 統計解析 平均 ± SEM 形式ですべてのデータを表示します。一方向の分散分析 (ANOVA) によるグループ間の違いは続いてテューキーの多重比較検定を決定します。テスト結果の有意性 α しきい値設定されたp < 0.05。