JoVE Journal > Developmental Biology
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Results
Discussion
Disclosures
Acknowledgements
Materials
References
Nederlands

Automatically Generated
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Developmental Biology

In Vitro Groei van de Preantral follikels muis onder gesimuleerde microzwaartekracht

Published: December 17, 2017
doi:
10.3791/55641
, , , , , , , ,
1Reproductive Medicine Center,The First Affiliated Hospital of Wenzhou Medical University, 2Department of Orthopaedics,The Second Affiliated Hospital of Wenzhou Medical University, 3Department of Obstetrics,The First Affiliated Hospital of Wenzhou Medical University, 4School of Laboratory Medicine and Life Science,Wenzhou Medical University, 5School of Pharmaceutical Science,Wenzhou Medical University, 6Stem Cells and Genetic Engineering Group, AgriBioscience Research Centre,Department of Economic Development, Jobs, Transport and Resources, 7Department of Histology and Embryology,Wenzhou Medical University

Summary

Een zeer veelbelovende techniek voor het genereren van weefsel construeert zonder met behulp van matrix aan cultuur cellen in een gesimuleerde microzwaartekracht voorwaarde is. Met behulp van een roterende cultuur systeem, onderzochten we ovariële follikel groei en oöcyt rijping in termen van overleving van de follikel, morfologie, groei en oöcyt functie onder de voorwaarde van de gesimuleerde microzwaartekracht.

Abstract

14 dagen oude muis ovariaal weefsel en preantral follikels geïsoleerd van dezelfde leeftijd muizen werden geïncubeerd in een gesimuleerde microzwaartekracht cultuur systeem. We kwantitatief beoordeeld follikel overleving, gemeten follikel en oöcyt diameters, en onderzocht ultrastructuur van de eicellen geproduceerd uit het systeem. We verminderde follikel overleving waargenomen, Downregulatie van uitingen van prolifererende cel nucleair antigeen en differentiatie groeifactor 9, als indicatoren voor de ontwikkeling van granulosa cellen en eicellen, respectievelijk, en oöcyt ultrastructurele afwijkingen onder de voorwaarde van de gesimuleerde microzwaartekracht. De gesimuleerde microzwaartekracht experimentele opzet moet worden geoptimaliseerd om een model voor onderzoek van de mechanismen die betrokken zijn bij de oöcyt/follikel in vitro ontwikkeling.

Introduction

In vitro ovariële follikel ontwikkeling en rijping van de oöcyt hebben bereikt met behulp van traditionele methoden voor 2-dimensionale cultuur, zoals op het oppervlak van petrischalen, en drie dimensionale (3D) matrix, zoals alginaat en hydrogel1 ,2,3. Een 3D cultuur systeem effectief gehandhaafd follikels in een weefsel-achtige structuur en bewaard het soortgelijk gen expressieprofielen als in vivo4 follikels en geproduceerd meiotically bevoegde eicellen5,6. 3D cultuur systemen kunnen ook in een matrix-free conditie worden vastgesteld, bijvoorbeeld hangende drop schorsing en glooiende vaartuigen. De roterende muur vaartuig (RWV) ontwikkeld door het National Aeronautics and Space Administration (NASA) genereert een gesimuleerde microzwaartekracht (s-µg) voor de binnen het schip7gekweekte cellen. Deze gesimuleerde microzwaartekracht voorwaarde biedt een unieke cultuur systeem voor celproliferatie en differentiatie vanwege het ontbreken van sedimentatie voor convectie. Het is aangetoond dat gesimuleerde microzwaartekracht bevorderd endothelial vaartuig vorming van endotheliale cellen8,9, schildklier weefsel samenstellen uit de schildklier cellen10, en chondrogenesis van adipeus-afgeleid mesenchymale stamcellen in RWV apparaten11. Andere studies hebben echter aangetoond dat de gesimuleerde microzwaartekracht apoptosis in maag cellen veroorzaakte en B lymphoblasts12,13,14, de gevolgen van suggereren microzwaartekracht op cellulaire schade gesimuleerde kan altijd type-afhankelijke cel. Gesimuleerde microzwaartekracht kan ook leiden tot veranderingen op ultrastructureel niveau, zoals gemeld in de organisatie van gestoorde spindel en geïnduceerde cytoplasmatische blebbing in eicellen15. De geoptimaliseerde gesimuleerde microzwaartekracht voorwaarden en mechanismen die tissue engineering of cellulaire letsel onder het systeem veroorzaken nader onderzoek. In vitro experimenten van het kweken van ovariële follikels/eicellen RWV apparaten met kunnen waardevolle informatie verschaffen over de oöcyt gene expressies en ultrastructures van de oöcyt organellen. In deze studie, eierstokweefsel met preantral follikels en geïsoleerde preantral follikels gewend was het onderzoeken van de effecten van gesimuleerde microzwaartekrachtop ontwikkeling en oöcyt rijping van de follikel.

In deze studie, eierstokweefsel met preantral follikels en geïsoleerde preantral follikels werden gebruikt om de onderzoeken van de effecten van gesimuleerde microzwaartekracht op ontwikkeling en oöcyt rijping van de follikel. In onze studie, de RWV, bieden een gesimuleerde microzwaartekracht apparaat, draait rond een horizontale as binnen een 5% CO2 incubator, een aandoening van de gesimuleerde microzwaartekracht met efficiënte oxygenatie en zeer lage schuifspanning. We geanalyseerd de gene uitingen van een delende cel nucleair antigeen (PCNA) en differentiatie groeifactor 9 (GDF-9) als indicatoren voor de ontwikkeling van granulosa cellen en eicellen, respectievelijk. Wij laten zien dat PCNA en GDF-9 expressies in de granulosa cellen en eicellen, respectievelijk onderdrukt werden wanneer gekweekt in de RWV-apparaat, en we de terugtrekking van de oöcyt microvilli van de zona zitten in de follikels gekweekt onder de s-µ toonden g aandoening, die vergelijkbaar met dat van GDF-9-deficiënte muis follikels16 was.

Protocol

Ethische goedkeuring voor deze studie werd verkregen van de Animal Research ethiek Commissie van Wen Zhou Medical College. 1. bereiding van de voedingsbodems en alginaat Hydrogel Eierstokweefsel en follikel behandeling medium gebruik L-15 gemiddeld met 10% foetale runderserum, 100 IU/mL penicilline en 100 µg/mL streptomycine voorbereiden. Bewaren bij 4 ° C voor twee weken. Bereiden van eierstokweefsel en follikel kweekmedium bestaande uit alpha-minimaal essentiële medium [α-MEM] aangevuld met 5% foetale runderserum [FBS], 1% insuline-selenium-transferrine, 10 mIU/ml rFSH 100 IU/mL penicilline en 100 µg/mL streptomycine. Bewaren bij 4 ° C voor twee weken. Alginaat hydrogel 0,8% (m/v) natrium alginaat oplossing met steriel PBS voor te bereiden, dan daling van 10 µL van deze oplossing in de oplossing (140 mM NaCl /50 mM CaCl2) van de inkapseling alginaat kralen maken.Opmerking: De grootte van de kraal alginaat is ongeveer 3 mm diameter. 2. muis follikel isolatie en inkapseling Ruiming van 14 dagen oude ICR vrouwelijke muizen door cervicale dislocatie, verwijderen eierstokken aseptisch met behulp van schaar en pincet en eierstokken gestoken 2 mL behandeling van medium. Snij de eierstokken doormidden met behulp van een scalpel. De half-sized eierstokweefsel was ongeveer 1 mm dikte voor cultuur in het kweekmedium. Handmatig isoleren van de follikels van eierstokken gebruik 26 1/2-guage naalden onder een 2-4 X stereomicroscoop en verzamelen van de geselecteerde follikels voor cultuur in het kweekmedium.Opmerking: Criteria voor de selectie van de follikel: 1) follikels zijn ronde met eicellen in het midden en 2-3 lagen van granulosa cellen rondom de eicellen, 2) follikels had een intact basale membraan bevestigd met sommige theca cellen, en 3) follikel grootte was 90-100 µm in diameter Alginaat kralen per stap 1.3 maken Wassen van de follikels met alginaat oplossing en pipetteer dan een één follikel in het midden van elke alginaat parel om er zeker van te zijn dat elke kraal bevat een één follikel onder een stereomicroscoop. Na het spoelen in een kweekvloeistof, cultuur het alginaat kralen in 150 µL cultuurmedium in a 35 × cultuur 10 mm schotel of een RWV-apparaat. 3. eierstokweefsel of follikel cultuur onder gesimuleerde microzwaartekracht Een RWV-apparaat gebruiken voor het genereren van gesimuleerde microzwaartekracht. Vul het vaartuig met lichte Paraffineolie (~ 10 mL), 150 µL cultuurmedium plaats in een druppel in de olie en Pipetteer ééndelig van eierstokweefsel of drie alginaat kralen met ingekapselde follikels in de middelgrote druppel. Sluit het vaartuig poort GLB en lossen van het schip op de roterende basis van het apparaat. Groepen, plaats alginaat kralen met follikels in control of eierstokweefsel in 150 µL cultuurmedium in een droplet bedekt met lichte paraffineolie in 35 × 10 mm cultuur gerechten. Incubeer de cultuur gerechten én de RWV apparaat in een bevochtigde incubator bij 37 ° C met 5% CO2 in lucht. Kweekmedium in RWV apparaat wijzigen: giet de olie en het medium van het vaartuig in een 150 × 20 mm cultuur schotel, overdracht van de ovariële weefsels of alginaat parels aan een cultuur-schotel met kweekmedium. Herstel van het informatiesysteem voor de zeescheepvaart cultuur per stap 3.1. 4. het uitpakken van gegevenspakketten verstaan en follikel ophalen Giet de olie en het medium van het vaartuig in een 150 × 20 mm cultuur schotel na 4 dagen van kweken. Alginaat kralen en decapsulate follikels van de kralen alginaat halen door aan het broeden in de behandeling van medium aangevuld met 10 U/mL alginaat lyase gedurende 30 minuten bij 37 ° C. Verzamelen van follikels en dan was ze bij de behandeling van medium onder een stereomicroscoop. 5. eierstokweefsel en follikel beoordeling Cel levensvatbaarheid Assay Spoel de gepelde follikels driemaal in D-PBS, en ze vervolgens uit te broeden in 150 µL van de gecombineerde cel levensvatbaarheid Assay reagentia (2 µM calceïne AM en 4 µM EthD-1) bij kamertemperatuur gedurende 45 minuten. Follikels overbrengen in een schone microscoopglaasje met 10 µL D-PBS, dek af met een dekglaasje aan, en dan zegel met duidelijke vingernagel Pools. Graaf groene en rode bloedcellen in de dia’s onder een confocal fluorescentie Microscoop (400 X).Opmerking: In deze levensvatbaarheid assay, groene cellen zijn levende cellen, en rode bloedcellen zijn dode cellen. Follikels met minder dan 10% rode bloedcellen (doden) worden beschouwd als overleefde follikels. De Haematoxyline en eosine (H & E) kleuring van eierstokweefsel en follikel Vers 14 dagen oude muis eierstokken en preantral follikels van 14 dagen oude muizen in Bouin de oplossing als dag 0 monsters geïsoleerd vast te stellen. Fix de gekweekte eierstokweefsel na de 2-daagse of 4-daagse cultuur en individuele follikels binnen de alginaat kralen na de 4-daagse cultuur als experimentele monsters. Alle monsters inbedden in paraffine, sectie serieel bij 5 µm dikte, en vervolgens vlek met H & E volgens de instructies van de fabrikant. Het tellen van de follikel en Diameter meting In de eierstokken weefselsecties gekleurd met H & E, tellen alle follikels en gezonde preantral follikels binnen het gebied van de sectie weefsel onder een microscoop (400 X vergroting). Follikel dichtheid berekenen door het aantal preantral follikels door het totale aantal follikels te delen.Opmerking: de gezonde preantral follikels worden met ten minste twee lagen van granulosa cellen. Maatregel follikel en oöcyt diameter van de follikels van de dag 0 en dag 4 gekweekt follikels. Immunohistochemistry Eierstokweefsel hersteld in 4% paraformaldehyde inbedden in paraffine, sectie bij 5-µm-dikte, en mount weefselsecties op dia’s. Dewax van de secties, hydrateren, en broeden ze in citraat buffer voor 15 min. blok de endogene peroxydase in 3% waterstofperoxide, ontmaskert antigeen in 5% geit serum en vervolgens Incubeer met primaire antilichamen bij kamertemperatuur gedurende 3 uur. Wassen in PBS voor 3 min en Incubeer de dia’s met 1:500 verdund horseradish peroxidase (HRP)-geconjugeerd geit anti-konijn IgG (H + L) gedurende 1 uur bij kamertemperatuur.Opmerking: De primaire antilichamen gebruikt in de studie werden konijn anti-GDF-9 antilichaam (1:500 verdunning) en konijn anti-PCNA antistof (1:200 verdunning). Incubeer ovariële sectie dia’s met 3, 3′-Diaminobenzidine [DAB] te detecteren het peroxidase activiteit en monteer op glas dia’s met waterige montage medium. Observeren van ovariële sectie dia’s onder een microscoop op 400 X vergroting. Transmissie-elektronenmicroscopie [TEM] Fix follikels in 2,5% Glutaaraldehyde gedurende 3 uur bij kamertemperatuur, dan na oplossen in 1% osmium tetroxide gedurende 1 uur bij 37 ° C.Wassen met PBS, dan behandelen de follikels met 1% phosphotungstic zuur en 1% uranyl Natriumacetaat gedurende 1 uur bij 37 ° C. Uitdrogen van de follikels met behulp van een reeks van aceton: 25, 50, 75, 95, 100% (3 keer), en epoxy hars-aceton mengsel na de laatste 100% aceton stap bij 37 ° C, en vervolgens insluiten in epoxyhars bij 45 ° C. De ingesloten blokken gesneden 1.0 µm semi-dunne secties, en vlekken van de secties met 1% methyleenblauw voor 1-2 min te lokaliseren van de follikels in de blokken. Snijd de ingesloten blokken in 50 nm uiterst dunne secties en bevestig de secties op rasters voor TEM. 6. statistische analyse Alle gegevens presenteren in gemiddelde ± SEM formaat. Bepalen dat de verschillen tussen groepen door one-way variantieanalyse (ANOVA) gevolgd door Tukey meerdere vergelijkingstest. De α-drempel voor test resultaat significantie werd vastgesteld op p < 0.05.

Representative Results

Figuur 1A blijkt een RWV met olie binnen het schip. Een droplet 150 µL medium dat ééndelig van eierstokweefsel of drie alginaat kralen met ingekapselde follikels werd gebracht in de olie. De middellange druppel werd gehouden in een staat van de eindsnelheid te wijten aan de vloeistof slepen op de druppels binnen de roterende olie tempo van 25 rotaties per minuut, waardoor de voorwaarde van een gesimuleerde microzwaartekracht (s-µg) gegenereerd. In een controle-experiment, eierstokweefsel of ingekapselde follikels werden gekweekt in een druppel van 150 µL medium bedekt met minerale olie in 35 × 10 mm gerechten (figuur 1B), die gegenereerd een 1 -g voorwaarde. Om te bestuderen van de effecten van gesimuleerde microzwaartekracht op preantral follikel ontwikkeling in vitro, gekweekte we de eierstokweefsel 14 dagen oude muis onder 1 -g (controle-experiment) of s-µg voorwaarden. Wij telde het aantal van gezonde follikels in de H & E gekleurd secties in twee voorwaarden na 0, 2 en 4 dagen van cultuur (Figuur 2). We vonden dat het voortbestaan van de follikel in eierstokweefsel behandeld in de s-µg voorwaarde aanzienlijk lager dan onder de 1 was -g staat op dag 2 en dag 4 van het kweken (p < 0,05, ANOVA). Bovendien vonden we dat geen PCNA positieve signalen werden ontdekt in de ovariaal weefsel onder de s-µg voorwaarde (Figuur 3). In de cultuur van geïsoleerde preantral follikels ingekapseld in alginaat kralen, wij geopenbaard dat aanzienlijk meer follikels onder 1 overleefde -g voorwaarde (76,8% ± 5,3%, n = 227) dan s-µg voorwaarde (54,4% ± 6,7%, n = 249) op dag 4 van het kweken . Daarnaast oöcyt grootte had geen significante toename na 4 dagen van kweken, hoewel de follikel grootte aanzienlijk toegenomen onder de voorwaarden van beide zwaartekracht (Figuur 4). Follikels met minder dan 10% dode granulosa cellen (Figuur 5) waren echter aanzienlijk lager onder de 1 -g voorwaarde (81,5 ± 5%, n = 10) dan onder s-µg voorwaarde (90 ± 8%, n = 10) (p < 0,05). Om te onderzoeken de effecten van gesimuleerde microzwaartekracht op oöcyt functionaliteit, onderzochten we de expressie van de oöcyt-specifieke markering GDF-9. We toonden aan dat GDF-9 expressie opmerkelijk naar beneden-geregeld in de eierstokweefsel onder s-µg voorwaarde (Figuur 6 was). Daarnaast wij frequente ultrastructurele afwijkingen van de oöcyt organellen in de ingekapselde follikels aangetoond op dag 4 van cultuur onder de s-µg voorwaarde (Figuur 7). Figuur 1 : Installatie van s -µg en 1g cultuur voorwaarden. (A) s-µg werd bedacht door de roterende muur vaartuig en houden de onderwerpen cultuur in een staat van constante vrije val binnen de bewegende olie. (B) A 1 -g conditie was gemaakt door het kweken van eierstokweefsel of follikels op het oppervlak van een petrischaal bedekt met minerale olie. De pijl geeft een druppel medium. Schaal bar = 1 cm. Dit cijfer is gewijzigd van Zhang et al. 17 Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer. Figuur 2 : Effecten van s-µg op de eierstokken weefselkweek. (A) secties van eierstokweefsel gekweekte onder 1 -g of s-µg voorwaarden 0, 2 en 4 dagen. Schaal bar = 50 µm. (B) follikel dichtheid in de secties eierstokweefsel. Fout bar vertegenwoordigt 1 SEM, *: p < 0.05. Dit cijfer is gewijzigd van Zhang et al. 17 Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer. Figuur 3 : Immunohistochemistry van PCNA. PCNA eiwit expressie werd onderzocht in de granulosa cellen in de eierstokweefsel gekweekte onder 1 -g of s-µg voorwaarden 0, 2 en 4 dagen. Schaal bar = 50 µm. Dit cijfer is gewijzigd van Zhang et al. 17 Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer. Figuur 4 : Effecten van s-µg op de cultuur van encapsulated preantral follikels in alginaat kralen. (A) morfologie van preantral follikels gekweekte onder 1 -g of s-µg voorwaarden 0 dagen en 4 dagen. Schaal bar = 50 oöcyt diameter µm. (B) en (C) follikel diameter werden vergeleken tussen 1 g en s-µg voorwaarden. Fout bar vertegenwoordigt 1 SEM, *: p < 0.05. Dit cijfer is gewijzigd van Zhang et al. 17 Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer. Figuur 5 : Cel levensvatbaarheid assay. Representatieve beelden werden genomen onder een microscoop op 400 X vergroting. De assay toepassingen calceïne AM te visualiseren van levende cellen gekleurd in het groen en EthD-1 om te visualiseren van de kernen van dode cellen gekleurd in rood. (A): een follikel met ~ 100% live granulosa cellen (groen). (B): een follikel met live granulosa cellen (groen), evenals meer dan 10% dode cellen (rood). Schaal bar = 50 µm.Dit cijfer is gewijzigd van Zhang et al. 17 Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer. Figuur 6 : Immunohistochemistry van GDF-9. GDF-9 eiwituitdrukking werd onderzocht in de eicellen in de eierstokweefsel gekweekte onder 1 -g of s-µg voorwaarden 0, 2 en 4 dagen. Schaal bar = 50 µm. Dit cijfer is gewijzigd van Zhang et al. 17 Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer. Figuur 7 : Ultrastructurele analyse van geïsoleerde preantral follikels gekweekt onder 1 – g of s-µ g voorwaarden op dag 4 van cultuur. (A) een oöcyt met microvilli (pijlen) uit te breiden in de zona zitten (1 -g voorwaarde). (B-F) Eicellen met grote vacuolen (*), multilamellar organen (#), lipide druppels (pijlen), vacuolated mitochondriën ontbreekt cristae (pijl), en verspreiden van Golgi-apparaat (pijl), respectievelijk (s-µg voorwaarde). O: oöcyt; ZP: zona zitten. Dit cijfer is gewijzigd van Zhang et al. 17 Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Discussion

De kritische stappen voor het kweken van de succesvolle preantral follikels zijn: 1) correct te selecteren van de preantral follikels volgens de selectiecriteria die werden beschreven in Protocol tekst 2.1); 2) alle procedures in een sceptisch voorwaarde preforming en onderhouden van een steriele cultuur; en 3) correct instellen van de RWV cultuur systeem.

Het behoud van de samenhang van experimentele waarnemingen in de repliceren experimenten is om soortgelijke of identieke materialen te gebruiken. De criteria voor de selectie van muis preantral follikels onthulde dat de follikels had 1) gezonde eicellen stadium germinal vesikel verdeling (GVBD) omgeven door een dunne zona zitten; 2) 2-3 lagen van granulosa cellen omsloten door een basale membraan; en 3) aantal thecal cellen gekoppeld aan de basale membraan. Dus, de follikels geselecteerd had niet alleen alle drie functionele compartimenten van een ovariële follikel ter ondersteuning van de oöcyt groei, maar ook een soortgelijk morfologische identificatie met een diameter van 90-100 µm.

Dit is de eerste poging om het groeien van de muis preantral follikels in de wijze van 3D kweken onder de gesimuleerde microzwaartekracht. Verschillende cultuur systemen zijn ontwikkeld voor muis preantral follikels. Eicellen in de follikel gekweekt op een vlakke ondergrond van petrischalen, de zogenaamde 2D cultuur, verkregen kon worden bevrucht en levende nakomelingen geproduceerd. Bovendien handhaven 3D culturen, zoals culturen van follikels in alginaat kralen, een weefsel structuur vergelijkbaar met wat het lichaam in hoog percentage meiotically bevoegde eicellen produceert. Het ontwikkelingsproces van ovariële follikels/eicellen in een nul-zwaartekracht veld is echter onbekend. RWV, een apparaat dat is het aantrekken van aanzienlijke aandacht in weefselengineering, kunt genereren een gesimuleerde microzwaartekracht omgeving en bieden een ideale omgeving voor het onderzoeken van de effecten van gesimuleerde microzwaartekracht op de groei van de ovariële follikel/eicellen in vitro.

Het is belangrijk dat het toestel van de RWV goed voor de cultuur van de cel instelt. De luchtbellen in het vaartuig moeten worden verwijderd. De methode voor het verwijderen van luchtbellen, als gegenereerd in het vat, is als volgt: plaats twee injectiespuiten met 0,5 mL olie in elk van de twee spuit-poorten. Open de kleppen regelen de spuit-poorten. Manoeuvreren luchtbellen onder de poort van de spuit. Trek de bubbels in de spuit terwijl ongeveer hetzelfde volume van media via de andere poort van de spuit te injecteren. Nadat alle bubbels zijn verwijderd, sluiten de kleppen, verwijder de spuiten, en vervang de spuit poort caps. Het is ook cruciaal om te achterhalen van de juiste rotatiesnelheid, die voorkomt dat cellen regelen via een constante rotatie. Optimalisatie van de rotatiesnelheid wordt bepaald door het soortelijk gewicht van de cellen, de dichtheid van de vloeistof en de viscositeit.

De expressieprofielen van PCNA en GDF-9, die vergelijkbaar met die in GDF-9-deficiënte muis follikels16 waren, onthulde dat gesimuleerde microzwaartekracht had nadelige gevolgen voor de ontwikkeling van granulosa cellen en eicellen. Het schip van de RWV apparaat gesponnen rond een horizontale as binnen een 5% CO2 incubator, waardoor voor permeatie van zuurstof en koolstofdioxide via een membraan in de rug, het verstrekken van efficiënte oxygenatie en zeer lage schuifspanning, dat was waarschijnlijk niet de oorzaak van de schade van de follikel/oöcyt. Optimalisatie van de experimentele opstelling en verdere analyses nodig zijn om te onderzoeken van het mechanisme van de schadelijke effecten.

Verdere studies zijn nodig om te onderzoeken het ontwikkelings potentieel van de eicellen in vitro afgeleid van de RWV cultuur systeem. Rijping in vitro van oöcyten naar MII fase wordt momenteel uitgevoerd. De uiteindelijke validatie van deze cultuur-systeem zal worden onderzocht door de capaciteit van de bevruchting van de opgehaalde eicellen.

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

De auteurs bedank Yilong Wang en Yanlin Zhao voor hun hulp bij het handhaven van de dieren, Chan voor haar hulp bij de voorbereiding van de histologische monsters Zhang en Dr. Songtao He voor het kritisch lezen van dit manuscript. Dit werk werd gesteund door de Natural Science Foundation van de Zhejiang provincie (verlenen van nummer: LY13C120002).

Materials

ICR mice SLRC Laoratory 14-day-old female mice
L-15 medium Sigma L1518 With L-glutamine, liquid, sterile-filtered, suitable for cell culture
fetal bovine serum Gibco 10100147 Origin: Australia
Penicillin V potassium Sigma 1504503 United States Pharmacopeia (USP) Reference Standard (USP)
Streptomycin sesquisulfate hydrate Sigma 46754 Analytical standard
Universal Click Pen Needles Penfine 12×1/2" 0.33×12 mm
Alginate Sigma W201502
alpha-minimal essential medium Sigma M0894 Alpha Modification, with L-glutamine, without ribonucleosides, deoxyribonucleosides and sodium bicarbonate, powder, suitable for cell culture
Insulin-selenium-transferrin Invitrogen 51500056 Liquid, sterile-filtered, BioReagent, suitable for cell culture
GONAL-F Merck Serono Recombinant follitropin alfa for injection
Disposable high-aspect-ratio rotating vessel Synthecon 10 mL
Culture oil Vitrolife Sterile light paraffin oil
Alginate Lyase Sigma A1603 powder, >10,000 units/g solid
26 1/2-guage needle Becton Dickinson
35×10mm dish Becton Dickinson
Viability/Cytotoxicity assay Kit Invitrogen L3224
Bouin’s solution Sigma HT10132
Horseradish peroxidase (HRP)-conjugated goat anti-rabbit IgG (H+L) Jackson Immuno-Research Laboratories 111-035-003
3,3N-Diaminobenzidine Tertrahydrochloride Beyotime P0203
Aqueous mounting medium Dako C0563
Rabbit anti-GDF-9 antibody Beijing Biosynthesis Biotechnology BS-175R
Rabbit anti-PCNA antibody Proteintech 24036-1-AP
Methylene blue Sigma M9140
Transmission electron microscope Hitachi H-7500
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Eppig, J. J., Schroeder, A. C. Capacity of mouse oocytes from preantral follicles to undergo embryogenesis and development to live young after growth, maturation, and fertilization in vitro. Biol Reprod. 41, 268-276 (1989).
  2. O’Brien, M. J., Pendola, J. K., Eppig, J. J. A revised protocol for in vitro development of mouse oocytes from primordial follicles dramatically improves their developmental competence. Biol Reprod. 68, 1682-1686 (2003).
  3. Liu, J., Van der Elst, J., Van den Broecke, R., Dhont, M. Live offspring by in vitro fertilization of oocytes from cryopreserved primordial mouse follicles after sequential in vivo transplantation and in vitro maturation. Biology of Reproduction. 64, 171-178 (2001).
  4. Parrish, E. M., Siletz, A., Xu, M., Woodruff, T. K., Shea, L. D. Gene expression in mouse ovarian follicle development in vivo versus an ex vivo alginate culture system. Reproduction. 142, 309-318 (2011).
  5. Xu, M., Kreeger, P. K., Shea, L. D., Woodruff, T. K. Tissue-engineered follicles produce live, fertile offspring. Tissue Eng. 12, 2739-2746 (2006).
  6. Xu, M., West, E., Shea, L. D., Woodruff, T. K. Identification of a stage-specific permissive in vitro culture environment for follicle growth and oocyte development. Biol Reprod. 75, 916-923 (2006).
  7. Grimm, D., et al. Growing tissues in real and simulated microgravity: new methods for tissue engineering. Tissue engineering. Part B, Reviews. 20, 555-566 (2014).
  8. Grimm, D., et al. Different responsiveness of endothelial cells to vascular endothelial growth factor and basic fibroblast growth factor added to culture media under gravity and simulated microgravity. Tissue engineering Part A. 16, 1559-1573 (2010).
  9. Grimm, D., et al. A delayed type of three-dimensional growth of human endothelial cells under simulated weightlessness. Tissue engineering. Part A. 15, 2267-2275 (2009).
  10. Pietsch, J., et al. Interaction of proteins identified in human thyroid cells. International journal of molecular sciences. 14, 1164-1178 (2013).
  11. Yu, B., et al. Simulated microgravity using a rotary cell culture system promotes chondrogenesis of human adipose-derived mesenchymal stem cells via the p38 MAPK pathway. Biochem Biophys Res Commun. 414, 412-418 (2011).
  12. Maier, J. A., Cialdai, F., Monici, M., Morbidelli, L. The impact of microgravity and hypergravity on endothelial cells. Biomed Res Int. 2015, 434803 (2015).
  13. Zhu, M., Jin, X. W., Wu, B. Y., Nie, J. L., Li, Y. H. Effects of simulated weightlessness on cellular morphology and biological characteristics of cell lines SGC-7901 and HFE-145. Genet Mol Res. 13, 6060-6069 (2014).
  14. Dang, B., et al. Simulated microgravity increases heavy ion radiation-induced apoptosis in human B lymphoblasts. Life Sci. 97, 123-128 (2014).
  15. Wu, C., et al. Simulated microgravity compromises mouse oocyte maturation by disrupting meiotic spindle organization and inducing cytoplasmic blebbing. PLoS One. 6, e22214 (2011).
  16. Dong, J., et al. Growth differentiation factor-9 is required during early ovarian folliculogenesis. Nature. 383, 531-535 (1996).
  17. Zhang, S., et al. Simulated Microgravity Using a Rotary Culture System Compromises the In Vitro Development of Mouse Preantral Follicles. PLoS One. 11, e0151062 (2016).

Tags

Mouse Preantral FolliclesIn Vitro GrowthSimulated MicrogravityFollicle IsolationFollicle EncapsulationAlginate BeadsRotating Culture SystemIn Vitro CultureControl GroupMicrogravity Treatment

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Cite This Article
Zhang, S., Wu, Y., Weng, Y., Xu, Z., Chen, W., Zheng, D., Lin, W., Liu, J., Zhou, Y. In Vitro Growth of Mouse Preantral Follicles Under Simulated Microgravity. J. Vis. Exp. (130), e55641, doi:10.3791/55641 (2017).
Download Citation
Reprints and Permissions

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image