JoVE Journal > Developmental Biology
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Results
Discussion
Disclosures
Acknowledgements
Materials
References
العربية

Automatically Generated
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Developmental Biology

في المختبر نمو بصيلات بريانترال الماوس تحت ظروف محاكاة الجاذبية الصغرية

Published: December 17, 2017
doi:
10.3791/55641
, , , , , , , ,
1Reproductive Medicine Center,The First Affiliated Hospital of Wenzhou Medical University, 2Department of Orthopaedics,The Second Affiliated Hospital of Wenzhou Medical University, 3Department of Obstetrics,The First Affiliated Hospital of Wenzhou Medical University, 4School of Laboratory Medicine and Life Science,Wenzhou Medical University, 5School of Pharmaceutical Science,Wenzhou Medical University, 6Stem Cells and Genetic Engineering Group, AgriBioscience Research Centre,Department of Economic Development, Jobs, Transport and Resources, 7Department of Histology and Embryology,Wenzhou Medical University

Summary

بنيات تقنية واعدة جداً لتوليد الأنسجة دون استخدام مصفوفة لخلايا الثقافة في حالة محاكاة الجاذبية الصغرية. باستخدام نظام ثقافة روتاري، قمنا بدراسة نمو جريب المبيض ونضوج البويضات من حيث بقاء المسام ومورفولوجيا، والنمو، والدالة البويضيه تحت ظروف محاكاة الجاذبية الصغرية.

Abstract

كانت المحتضنة أنسجة المبيض الماوس عمره يوما والمسام بريانترال المعزولة من الفئران نفس سن 14 في نظام ثقافة محاكاة الجاذبية الصغرية. الكمية قيمنا بقاء المسام والمسام المقاسة وأقطار البويضيه، ودرست أولتراستروكتوري بويضات أنتجت من هذا النظام. لاحظنا بقاء جريب انخفض، downregulation التعبير عن تكاثر الخلية مستضد النووية وعامل التمايز النمو 9، كمؤشرات لتنمية الخلايا granulosa وبويضات، على التوالي، والبويضات ultrastructural شذوذ تحت ظروف محاكاة الجاذبية الصغرية. يحتاج الإعداد التجريبي محاكاة الجاذبية الصغرية يكون الأمثل لتقديم نموذج لتحقيق الآليات المعنية بالبويضات/جريب التطوير في المختبر .

Introduction

في المختبر التنمية جريب المبيض ونضوج البويضات قد تحققت باستخدام الأساليب التقليدية للثقافة ثنائي الأبعاد، كما هو الحال على سطح أطباق بيتري، ومصفوفة (ثلاثي الأبعاد) الأبعاد الثلاثة، مثل الجينات والمائية1 ،،من23. نظام 3D ثقافة الحفاظ على المسام في بنية الأنسجة مثل فعالية وأبقى ملامح التعبير الجيني مماثلة كما في فيفوالمسام4 ، وإنتاج بويضات المختصة ميوتيكالي5،6. يمكن أيضا إنشاء أنظمة الثقافة 3D في حالة خالية من المصفوفة، على سبيل المثال، انخفاض معلقة تعليق والسفن المتداول. السفينة الجدار الدورية (روف) وضعتها “الإدارة الوطنية للملاحة الجوية” والفضاء (ناسا) يولد محاكاة الجاذبية الصغرية (s-μg) للخلايا المزروعة داخل السفينة7. هذا محاكاة الجاذبية الصغرية شرط توفر نظام ثقافة فريدة من نوعها لتكاثر الخلايا والتمايز بسبب عدم الترسيب للحمل الحراري. وقد ثبت أن محاكاة الجاذبية الصغرية تشجيع تشكيل السفينة غشائي من خلايا بطانية8،9, تجميع من خلايا الغدة الدرقية10، وتشوندروجينيسيس تستمد الدهنية أنسجة الغدة الدرقية الخلايا الجذعية الوسيطة في روف الأجهزة11. ومع ذلك، أظهرت دراسات أخرى أن محاكاة الجاذبية الصغرية التي يسببها المبرمج في خلايا المعدة وب ليمفوبلاستس12،،من1314، مما يوحي بالآثار محاكاة الجاذبية الصغرية على الضرر الخلوي قد تكون الخلايا المعتمدة على النوع. يمكن أيضا أن يسبب تغييرات على مستوى ultrastructural، كما ورد في المنظمة المغزل الانزعاج محاكاة الجاذبية الصغرية والتي يسببها بلبينغ هيولى في بويضات15. الشروط الأمثل محاكاة الجاذبية الصغرية والآليات التي تسبب إصابات الأنسجة الهندسة أو الخلوية تحت النظام تتطلب مزيدا من التحقيق. تجارب في المختبر لزراعة بصيلات/بويضات المبيض باستخدام أجهزة روف يمكن أن توفر معلومات قيمة في التعبير الجيني البويضات وأولتراستروكتوريس من العضيات البويضات. في هذه الدراسة، تم استخدام أنسجة المبيض التي تحتوي على بريانترال المسام وبصيلات بريانترال معزولة للتحقيق في آثار محاكاة الجاذبية الصغريةعلى نضوج البويضات والتنمية جريب.

في هذه الدراسة، استخدمت أنسجة المبيض التي تحتوي على بريانترال المسام وبصيلات بريانترال معزولة للتحقيق في آثار محاكاة الجاذبية الصغرية على نضج جريب التنمية والبويضات. في دراستنا، روف، توفير جهاز محاكاة الجاذبية الصغرية، ويدور حول محور أفقي داخل حاضنة2 CO 5% شرط محاكاة الجاذبية الصغرية بكفاءة الأوكسجين وإجهاد القص منخفضة جداً. قمنا بتحليل الجينات تعابير تكاثر الخلايا النووية مستضد (منها) وعامل نمو التمايز 9 (GDF-9) كمؤشرات لتنمية الخلايا granulosa وبويضات، على التوالي. أظهرنا أن تعبيرات منها وغاز فرنسا-9 تم منعها في الخلايا granulosa وبويضات، على التوالي، عندما مثقف في الجهاز روف، واظهرنا سحب البويضات زغيبات من بيلوسيدا زونا في المسام مثقف تحت s-μ ز الشرط، الذي يماثل في المسام الماوس GDF 9-تفتقر إلى16.

Protocol

تم الحصول على الموافقة الأخلاقية لهذه الدراسة من “الحيوان بحوث أخلاقيات اللجنة من ون تشو كلية الطب”. 1-إعداد وسائل الإعلام الثقافة والجينات المائية تعد أنسجة المبيض ومعالجة المسام المتوسطة استخدام L-15 المتوسطة مع 10% مصل بقرى الجنين، البنسلين 100 وحدة دولية/مل، و 100 ميكروغرام/مل ستربتوميسين. تخزين في 4 درجات مئوية لمدة أسبوعين. تعد أنسجة المبيض والمتوسطة الثقافة جريب تتألف من المتوسطة الأساسية الحد الأدنى ألفا [α-MEM [تستكمل مع 5% مصل بقرى الجنين [FBS]، 1% الأنسولين-السيلينيوم-ترانسفيرين 10 رفش mIU/ml والبنسلين 100 وحدة دولية/مل، وستربتوميسين 100 ميكروغرام/مل. تخزين في 4 درجات مئوية لمدة أسبوعين. إعداد الجينات المائية باستخدام حل الجينات صوديوم 0.8% (w/v) في برنامج تلفزيوني العقيمة، ثم إسقاط 10 ميليلتر لهذا الحل إلى الحل التغليف (140 ملم “كلوريد الصوديوم 50” مم كاكل2) لإنشاء الخرز الجينات.ملاحظة: حجم حبة الجينات كان حوالي 3 مم في القطر. 2-الفأر جريب العزل والتغليف إعدام 14 يوم من العمر الممثل المدني الدولي الفئران الإناث بخلع عنق الرحم، المبيضين إزالة أسيبتيكالي باستخدام مقص وملقط، ووضعت المبايض 2 مل من التعامل مع المتوسط. قص المبايض في نصف استخدام مشرط. وكان أنسجة المبيض نصف الحجم حوالي 1 مم سمك للثقافة في الأجلين المتوسط والثقافة. يدوياً عزل المسام من المبايض باستخدام الإبر 26 1/2-قياس تحت ستيريوميكروسكوبي X 2-4، وجمع المسام المحدد للثقافة في الأجلين المتوسط والثقافة.ملاحظة: جريب معايير الاختيار: 1) المسام كانت جولة مع بويضات في الوسط و 2-3 طبقات من الخلايا granulosa المحيطة ببويضات، 2) المسام غشاء القاعدي سليمة مرفقة مع بعض الخلايا القراب، وكان حجم 3) جريب 90-100 ميكرومتر في القطر إنشاء الخرز الجينات كل خطوة 1.3. أغسل المسام مع الحل الجينات وثم “الماصة؛” من جريب واحد في منتصف كل حبة الجينات للتأكد من كل حبة تحتوي على جريب واحد تحت ستيريوميكروسكوبي. بعد الشطف المتوسط الثقافة، والثقافة الجينات الخرز في 150 ميليلتر من مستنبت في × 35 ثقافة 10 مم طبق أو جهاز روف. 3-المبيض الأنسجة أو الثقافة جريب تحت ظروف محاكاة الجاذبية الصغرية استخدام جهاز روف لتوليد ظروف محاكاة الجاذبية الصغرية. تعبئة السفينة بزيت البارافين الخفيفة (~ 10 مل)، ووضع 150 ميليلتر من مستنبت في معالجة تجميعية في الزيت، ثم نقل قطعة واحدة من أنسجة المبيض أو ثلاث حبات الجينات مع بصيلات مغلفة في الحبرية المتوسطة. قم بإغلاق الغطاء الميناء السفينة وإصلاح السفينة على قاعدة الدورية للجهاز. في السيطرة على الجماعات، ضع الخرز الجينات التي تحتوي على بصيلات أو أنسجة المبيض إلى 150 ميليلتر من مستنبت في معالجة تجميعية مغطاة بزيت البارافين الخفيفة في 35 × ملم 10 ثقافة الأطباق. احتضان ثقافة الأطباق والجهاز روف في حاضنة هوميديفيد عند 37 درجة مئوية مع 5% CO2 في الهواء. لتغيير الثقافة المتوسطة في الجهاز روف: صب الزيت والمتوسطة من السفينة في 150 × 20 مم ثقافة طبق، نقل الخرز الجينات أو أنسجة المبيض إلى طبق ثقافة مع الثقافة المتوسطة. إعادة تأسيس نظام الثقافة السفينة الواحدة الخطوة 3.1. 4-إلغاء التغليف واسترجاع جريب بعد 4 أيام من استزراع، صب الزيت والمتوسطة من السفينة في 150 × 20 مم ثقافة طبق. التقاط حبات الجينات وجراب ديكابسولاتي من الخرز الجينات التي تفرخ في التعامل مع المتوسطة وتستكمل مع يو/مليلتر الجينات لياز 10 لمدة 30 دقيقة عند 37 درجة مئوية. جمع جراب ويغسل لهم في التعامل مع المتوسط تحت ستيريوميكروسكوبي. 5-المبيض الأنسجة وتقييم جريب فحص صلاحية خلية غسل المسام ديكابسولاتيد ثلاث مرات في برنامج تلفزيوني د، وثم احتضانها لهم في 150 ميليلتر من الكواشف “المقايسة بقاء الخلية” مجتمعة (كالسين 2 ميكرومتر صباحا و 4 ميكرومتر اتهد-1) في درجة حرارة الغرفة لمدة 45 دقيقة. نقل المسام إلى شريحة مجهر نظيفة مع 10 ميليلتر د-برنامج تلفزيوني، وتغطي مع ساترة، وثم ختم مع البولندية ظفر واضحة. الكونت الأخضر والأحمر الخلايا في الشرائح تحت مجهر الأسفار [كنفوكل] (400 X).ملاحظة: في هذا التحليل الجدوى، الخلايا الخضراء خلايا حية، والخلايا الحمراء هي الخلايا الميتة. وتعتبر المسام نجا المسام مع الخلايا الحمراء “أقل من 10%” (الميت). توضع وويوزين (ح & ه) تلطيخ أنسجة المبيض والمسام إصلاح جديدة عمرها 14 يوم الماوس المبايض والمسام بريانترال المعزولة من الفئران عمرها 14 يوما في الحل في بوين كعينات اليوم 0. إصلاح أنسجة المبيض مثقف بعد يومين أو 4 أيام والثقافة، والمسام الفردية داخل الخرز الجينات بعد 4 أيام الثقافة كنماذج تجريبية. تضمين جميع العينات في البارافين، قسم متسلسل في 5 ميكرون سمك، ووصمة عار ثم مع ح & ه وفقا لإرشادات الشركة المصنعة. عد المسام وقياس القطر في المقاطع أنسجة المبيض ملطخة ح & ه، عد جميع المسام وبصيلات بريانترال صحية داخل منطقة قسم الأنسجة تحت مجهر (التكبير 400 X). حساب كثافة المسام بقسمة عدد المسام بريانترال بالعدد الإجمالي للمسام.ملاحظة: المسام بريانترال صحية تلك الطبقات اثنين على الأقل من الخلايا granulosa. قياس القطر المسام والبويضات اليوم 0 المسام وبصيلات يوم 4 مثقف. إيمونوهيستوتشيميستري إصلاح أنسجة المبيض في بارافورمالدهيد 4%، وتضمين في البارافين، القسم 5-ميكرومتر-سمك، وتحميل المقاطع الأنسجة على الشرائح. ديواكس الفروع، ترطيب، واحتضان لهم في سترات المخزن المؤقت ل 15 دقيقة كتلة البيروكسيديز الذاتية في بيروكسيد الهيدروجين 3 ٪، وكشف مستضد في مصل الماعز 5% واحتضان ثم مع الأجسام المضادة الأولية في درجة حرارة الغرفة ح 3. غسل في برنامج تلفزيوني لمدة 3 دقائق، ثم احتضان الشرائح مع 1: 500 المخفف الفجل البيروكسيديز (HRP)-مترافق الماعز الأرنب المضادة مفتش (H + L) ح 1 في درجة حرارة الغرفة.ملاحظة: كانت الأجسام المضادة الأولية المستخدمة في الدراسة جسم الأرنب مكافحة–غاز فرنسا-9 (تخفيف 1: 500) والارنب منها مكافحة الأجسام المضادة (تخفيف 1: 200). احتضان الشرائح المقطع المبيض مع 3، 3 ‘–ديامينوبينزيديني [الدأب] للكشف عن النشاط البيروكسيديز وجبل على الشرائح الزجاجية مع تصاعد مائي المتوسطة. مراقبة قسم المبيض الشرائح تحت مجهر على 400 X التكبير. مجهر إلكتروني [ال] إصلاح المسام في 2.5 ٪ glutaraldehyde ح 3 في درجة حرارة الغرفة، ثم بعد إصلاح في أكسيد الاوزميوم 1% ح 1 في 37 درجة مئوية.يغسل مع برنامج تلفزيوني، ثم علاج المسام مع حمض فوسفوتونجستيك 1% وخلات اليورانيل الصوديوم 1% ح 1 في 37 درجة مئوية. يذوي المسام باستخدام سلسلة الأسيتون: 25، 50، 75، 95، و 100% (3 مرات)، وخليط الأسيتون راتنج الإيبوكسي بعد الأسيتون 100% النهائي خطوة في 37 درجة مئوية، وقم بتضمين في راتنج الإيبوكسي عند 45 درجة مئوية. قص القطع جزءا لا يتجزأ إلى أقسام شبه رقيقة 1.0 ميكرومتر، ووصمة عار المقاطع مع أزرق الميثيلين 1% لمدة 1-2 دقيقة لتعريب المسام في التكتلات. قص القطع المدمجة إلى 50 نانومتر سامسونج أقسام وتحميل المقاطع على الشبكات لل. 6. التحليل الإحصائي تقديم كافة البيانات في تنسيق يعني ± ووزارة شؤون المرأة. تحديد الاختلافات بين الجماعات عن طريق تحليل التباين أحادي الاتجاه (ANOVA) تليها توكي التجارب المقارنة متعددة. تم تعيين عتبة α أهمية نتيجة الاختبار في ف < 0.05.

Representative Results

ويبين الشكل 1A روف مع النفط داخل السفينة. وضع قطرات من 150 ميليلتر المتوسطة التي تحتوي على قطعة واحدة من أنسجة المبيض أو ثلاث حبات الجينات مع بصيلات مغلفة بالنفط. الحبرية المتوسطة أبقى في حالة محطة السرعة نظراً لسحب السوائل في القطرات داخل النفط الدورية بمعدل 25 تناوب في الدقيقة، التي ولدت شرط محاكاة الجاذبية الصغرية (s-μg). في تجربة التحكم، كان مثقف أنسجة المبيض أو المسام كابسولاتيد في معالجة تجميعية من 150 ميليلتر المتوسطة مغطاة بالزيت المعدني في 35 × 10 مم الأطباق (الشكل 1B)، التي ولدت 1-ز الشرط. لدراسة آثار الجاذبية الصغرية المحاكاة على جريب بريانترال التنمية في المختبر، ونحن مثقف أنسجة المبيض 14 يوم من العمر الماوس تحت 1-ز (تجربة التحكم) أو ظروف s-ميكروغرام. احصينا عدد المسام صحية في ح & ه الملون المقاطع في هذين الشرطين بعد أيام 0 و 2، و 4 من الثقافة (الشكل 2). وجدنا أن بقاء المسام في أنسجة المبيض تعامل في الشرطز s-μ كان أقل بكثير من التي تحت 1-شرطز في اليوم الثاني واليوم الرابع لاستزراع (ف < 0.05، ANOVA). وعلاوة على ذلك، وجدنا أن لا منها إيجابية تم الكشف عن الإشارات في أنسجة المبيض بشرطز s-μ (الشكل 3). في ثقافة معزولة المسام بريانترال مغلفة في الجينات الخرز، ونحن كشفت أن كبير نجا المسام أكثر تحت 1-شرطز (76.8 في المائة ± 5.3 في المائة، n = 227) من شرطز s-μ (± 54.4 في المائة 6.7%، ن = 249) في يوم 4 من استزراع . وبالإضافة إلى ذلك، حجم بويضتها كان لا زيادة كبيرة بعد 4 أيام من استزراع، على الرغم من المسام حجم زيادة كبيرة سواء في ظروف الجاذبية (الشكل 4). بيد أن المسام مع أقل من 10% granulosa الميت الخلايا (الشكل 5) كانت أقل بكثير إطار 1-شرطز (81.5 ± 5%، n = 10) من تحت شرطز s-μ (90 ± 8%، ن = 10) (ف < 0.05). للتحقيق في آثار محاكاة الجاذبية الصغرية على وظيفة البويضيه، قمنا بدراسة التعبير عن علامة محددة البويضيه GDF-9. أظهرنا أن التعبير GDF-9 كان ملحوظا لأسفل ينظم في أنسجة المبيض تحت شرطز s-μ (الشكل 6). وباﻹضافة إلى ذلك، أثبتنا شذوذ ultrastructural متكررة من العضيات البويضات في المسام مغلفة في اليوم الرابع للثقافة بشرطز s-μ (الشكل 7). الشكل 1 : برنامج الإعداد من s-μg و 1-ز الثقافة الشروط. (A) s-μغ تم إنشاؤه بتدوير السفينة الجدار وإبقاء المواضيع الثقافة في حالة الحرة مستمرة في نقل النفط. (ب) 1-ز الشرط تم إنشاؤه باستزراع الأنسجة المبيض أو المسام على سطح طبق بيتري مغطاة بالزيت المعدني. يشير السهم إلى معالجة تجميعية للمتوسطة. مقياس بار = 1 سم. وقد تم تعديل هذا الرقم من تشانغ et al. 17 الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم- الشكل 2 : آثار ميكروغرام s في زراعة أنسجة المبيض. (A) أجزاء من أنسجة المبيض شروطg أو s-μغ مثقف تحت 1-0 و 2، و 4 أيام. شريط المقياس = 50 ميكرومتر. (ب) جريب الكثافة في المقاطع أنسجة المبيض. خطأ بار SEM يمثل 1، *: ف < 0.05. وقد تم تعديل هذا الرقم من تشانغ et al. 17 الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم- الشكل 3 : إيمونوهيستوتشيميستري منها. تم بحث تعبير البروتين منها في الخلايا granulosa في أنسجة المبيض شروطg أو s-μغ مثقف تحت 1-0 و 2، و 4 أيام. شريط المقياس = 50 ميكرومتر. وقد تم تعديل هذا الرقم من تشانغ et al. 17 الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم- الشكل 4 : آثار μ sز على ثقافة المسام بريانترال مغلفة في الجينات الخرز. مورفولوجيا (A) من المسام بريانترال مثقف تحت 1-g أو s-μg الشروط لأيام 0 و 4 أيام. شريط المقياس = 50 ميكرومتر. (ب) البويضيه القطر والقطر جريب (ج) مقارنة بين ز 1 وظروفز s-μ. خطأ بار SEM يمثل 1، *: ف < 0.05. وقد تم تعديل هذا الرقم من تشانغ et al. 17 الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم- الشكل 5 : خلية بقاء المقايسة. وأخذت صور الممثل تحت مجهر على 400 X التكبير. استخدامات التحليل كالسين صباحا تصور الخلايا الحية الملون باللون الأخضر واتهد-1 تصور نويات الخلايا الميتة الملون باللون الأحمر. (أ): المسام مع الخلايا granulosa لايف ~ 100% (أخضر). (ب): المسام مع الخلايا granulosa لايف (الأخضر)، فضلا عن أكثر من 10% من الخلايا الميتة (أحمر). شريط المقياس = 50 ميكرومتر.وقد تم تعديل هذا الرقم من تشانغ et al. 17 الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم- الرقم 6 : إيمونوهيستوتشيميستري من غاز فرنسا-9- تم بحث تعبير البروتين GDF-9 في بويضات في أنسجة المبيض شروطg أو s-μغ مثقف تحت 1-0 و 2، و 4 أيام. شريط المقياس = 50 ميكرومتر. وقد تم تعديل هذا الرقم من تشانغ et al. 17 الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم- الشكل 7 : تحليل ultrastructural للمسام بريانترال معزولة مثقف تحت 1- ز أو s-μ ز الظروف في يوم 4 من الثقافة- (أ) البويضات مع زغيبات (الأسهم) تمتد إلى بيلوسيدا زونا (1-ز الشرط). (إف ب) بويضات مع كبير فاكوليس (*)، مولتيلاميلار الهيئات (#)، قطيرات الدهن (الأسهم)، والرغوة الميتوكوندريا التي تفتقر إلى كريستي (السهم)، وتشتيت جهاز غولجي (سهم)، على التوالي (شرطز s-μ). O: البويضيه؛ ZP: zona pellucida. وقد تم تعديل هذا الرقم من تشانغ et al. 17 الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Discussion

الخطوات الحاسمة لنجاح استزراع تجاويف بريانترال: 1) بشكل صحيح تحديد المسام بريانترال وفقا لمعايير الاختيار التي وصفت في 2.1 نص البروتوكول)؛ 2) preforming جميع الإجراءات في حالة تشكك والحفاظ على ثقافة عقيمة؛ و 3) إعداد بشكل صحيح في نظام الثقافة روف.

الحفاظ على اتساق الملاحظات التجريبية في تكرار التجارب استخدام مواد متشابهة أو متطابقة. معايير لاختيار الماوس بريانترال المسام كشفت أن المسام 1) بويضات صحية في مرحلة انهيار (جفبد) حويصلة جيرمنال محاطة بيلوسيدا زونا رقيقة؛ 2) 2-3 طبقات من الخلايا granulosa محاطة بغشاء القاعدي؛ و 3) بعض الخلايا thecal يعلق على الغشاء القاعدي. وهكذا، كان المسام المحدد ليس فقط كل ثلاث مقصورات الوظيفية جريب المبيض لدعم نمو البويضات، ولكن أيضا تحديد الخصائص مورفولوجية مماثلة يبلغ قطرها 90-100 ميكرومتر.

وهذا هو أول محاولة لزراعة بصيلات بريانترال الماوس في طريقة 3D استزراع تحت ظروف محاكاة الجاذبية الصغرية. وقد وضعت عدة نظم للثقافة للمسام بريانترال الماوس. يمكن أن تكون مخصبة بويضات تم الحصول عليها من المسام مثقف على سطح مستو من أطباق بيتري، ما يسمى بثقافة ثنائية الأبعاد، وتنتج ذرية حية. وعلاوة على ذلك، الثقافات ثلاثية الأبعاد، مثل الثقافات تجاويف في الجينات الخرز، الاحتفاظ ببنية أنسجة مشابهة للجسم ما ينتج في ارتفاع النسبة المئوية بويضات ميوتيكالي المختصة. ومع ذلك، عملية التنمية في المسام/بويضات المبيض في حقل الجاذبية صفر غير معروف. روف، جهاز الذي يجتذب اهتماما كبيرا في هندسة الأنسجة، يمكن أن تولد بيئة محاكاة الجاذبية الصغرية وتوفير بيئة مثالية للتحقيق في آثار محاكاة الجاذبية الصغرية على نمو جريب المبيض/بويضات في المختبر.

من المهم إعداد أجهزة روف ثقافة الخلية بشكل صحيح. يجب إزالة فقاعات الهواء في السفينة. طريقة لإزالة فقاعات الهواء، إذا ولدت في السفينة، وكما يلي: مكان الحقن اثنين مع 0.5 مل نفط في كل من موانئ اثنين حقنه. فتح صمامات التحكم في المنافذ المحاقن. مناورة فقاعات الهواء تحت المنفذ المحاقن. سحب الفقاعات في المحاقن أثناء الحقن تقريبا نفس حجم الوسائط عن طريق ميناء حقنه أخرى. بعد إزالة جميع فقاعات، إغلاق الصمامات وإزالة الحقن، واستبدال قبعات ميناء حقنه. من المهم أيضا معرفة سرعة دوران الصحيح، مما يمنع الخلايا من تسوية عن طريق تناوب مستمر. الأمثل لسرعة دوران يتحدد بوزن محدد من الخلايا وكثافة السوائل واللزوجة.

وكشفت ملامح التعبير منها وغاز فرنسا-9، ومماثلة لتلك الموجودة في المسام الماوس GDF 9-تفتقر إلى16، أن محاكاة الجاذبية الصغرية قد آثار ضارة على التنمية للخلايا granulosa وبويضات. سفينة الجهاز روف نسج حول محور أفقي داخل حاضنة2 CO 5%، تسمح بتخلل للأكسجين وثاني أكسيد الكربون عبر غشاء في الظهر، وتوفير الأوكسجين فعالة ومنخفضة للغاية القص الإجهاد، والتي كان من المرجح أن تكون سبب الإصابة جريب/البويضات. الأمثل للإعداد التجريبية وتحاليل أخرى مطلوبة للتحقيق في الآلية آثار ضارة.

يلزم إجراء مزيد من الدراسات التحقيق في إمكانات النمو في المختبر بويضات مستمدة من نظام الثقافة روف. حاليا تجري في المختبر نضوج بويضات إلى مرحلة صناعة المعلومات. سيدرس المصادقة النهائية على هذا النظام الثقافة قدرة إخصاب بويضات تم استردادها.

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

المؤلف يود أن يشكر ييلونغ وانغ تشاو صفحاتها لمساعدتها في الحفاظ على الحيوانات وتشانغ تشان لمساعدتها في إعداد عينات نسيجية والدكتور سونجتاو أنه للغاية قراءة هذا المخطوط. هذا العمل كان تدعمها “مؤسسة العلوم الطبيعية بمقاطعة تشجيانغ” (منح رقم: LY13C120002).

Materials

ICR mice SLRC Laoratory 14-day-old female mice
L-15 medium Sigma L1518 With L-glutamine, liquid, sterile-filtered, suitable for cell culture
fetal bovine serum Gibco 10100147 Origin: Australia
Penicillin V potassium Sigma 1504503 United States Pharmacopeia (USP) Reference Standard (USP)
Streptomycin sesquisulfate hydrate Sigma 46754 Analytical standard
Universal Click Pen Needles Penfine 12×1/2" 0.33×12 mm
Alginate Sigma W201502
alpha-minimal essential medium Sigma M0894 Alpha Modification, with L-glutamine, without ribonucleosides, deoxyribonucleosides and sodium bicarbonate, powder, suitable for cell culture
Insulin-selenium-transferrin Invitrogen 51500056 Liquid, sterile-filtered, BioReagent, suitable for cell culture
GONAL-F Merck Serono Recombinant follitropin alfa for injection
Disposable high-aspect-ratio rotating vessel Synthecon 10 mL
Culture oil Vitrolife Sterile light paraffin oil
Alginate Lyase Sigma A1603 powder, >10,000 units/g solid
26 1/2-guage needle Becton Dickinson
35×10mm dish Becton Dickinson
Viability/Cytotoxicity assay Kit Invitrogen L3224
Bouin’s solution Sigma HT10132
Horseradish peroxidase (HRP)-conjugated goat anti-rabbit IgG (H+L) Jackson Immuno-Research Laboratories 111-035-003
3,3N-Diaminobenzidine Tertrahydrochloride Beyotime P0203
Aqueous mounting medium Dako C0563
Rabbit anti-GDF-9 antibody Beijing Biosynthesis Biotechnology BS-175R
Rabbit anti-PCNA antibody Proteintech 24036-1-AP
Methylene blue Sigma M9140
Transmission electron microscope Hitachi H-7500
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Eppig, J. J., Schroeder, A. C. Capacity of mouse oocytes from preantral follicles to undergo embryogenesis and development to live young after growth, maturation, and fertilization in vitro. Biol Reprod. 41, 268-276 (1989).
  2. O’Brien, M. J., Pendola, J. K., Eppig, J. J. A revised protocol for in vitro development of mouse oocytes from primordial follicles dramatically improves their developmental competence. Biol Reprod. 68, 1682-1686 (2003).
  3. Liu, J., Van der Elst, J., Van den Broecke, R., Dhont, M. Live offspring by in vitro fertilization of oocytes from cryopreserved primordial mouse follicles after sequential in vivo transplantation and in vitro maturation. Biology of Reproduction. 64, 171-178 (2001).
  4. Parrish, E. M., Siletz, A., Xu, M., Woodruff, T. K., Shea, L. D. Gene expression in mouse ovarian follicle development in vivo versus an ex vivo alginate culture system. Reproduction. 142, 309-318 (2011).
  5. Xu, M., Kreeger, P. K., Shea, L. D., Woodruff, T. K. Tissue-engineered follicles produce live, fertile offspring. Tissue Eng. 12, 2739-2746 (2006).
  6. Xu, M., West, E., Shea, L. D., Woodruff, T. K. Identification of a stage-specific permissive in vitro culture environment for follicle growth and oocyte development. Biol Reprod. 75, 916-923 (2006).
  7. Grimm, D., et al. Growing tissues in real and simulated microgravity: new methods for tissue engineering. Tissue engineering. Part B, Reviews. 20, 555-566 (2014).
  8. Grimm, D., et al. Different responsiveness of endothelial cells to vascular endothelial growth factor and basic fibroblast growth factor added to culture media under gravity and simulated microgravity. Tissue engineering Part A. 16, 1559-1573 (2010).
  9. Grimm, D., et al. A delayed type of three-dimensional growth of human endothelial cells under simulated weightlessness. Tissue engineering. Part A. 15, 2267-2275 (2009).
  10. Pietsch, J., et al. Interaction of proteins identified in human thyroid cells. International journal of molecular sciences. 14, 1164-1178 (2013).
  11. Yu, B., et al. Simulated microgravity using a rotary cell culture system promotes chondrogenesis of human adipose-derived mesenchymal stem cells via the p38 MAPK pathway. Biochem Biophys Res Commun. 414, 412-418 (2011).
  12. Maier, J. A., Cialdai, F., Monici, M., Morbidelli, L. The impact of microgravity and hypergravity on endothelial cells. Biomed Res Int. 2015, 434803 (2015).
  13. Zhu, M., Jin, X. W., Wu, B. Y., Nie, J. L., Li, Y. H. Effects of simulated weightlessness on cellular morphology and biological characteristics of cell lines SGC-7901 and HFE-145. Genet Mol Res. 13, 6060-6069 (2014).
  14. Dang, B., et al. Simulated microgravity increases heavy ion radiation-induced apoptosis in human B lymphoblasts. Life Sci. 97, 123-128 (2014).
  15. Wu, C., et al. Simulated microgravity compromises mouse oocyte maturation by disrupting meiotic spindle organization and inducing cytoplasmic blebbing. PLoS One. 6, e22214 (2011).
  16. Dong, J., et al. Growth differentiation factor-9 is required during early ovarian folliculogenesis. Nature. 383, 531-535 (1996).
  17. Zhang, S., et al. Simulated Microgravity Using a Rotary Culture System Compromises the In Vitro Development of Mouse Preantral Follicles. PLoS One. 11, e0151062 (2016).

Tags

Mouse Preantral FolliclesIn Vitro GrowthSimulated MicrogravityFollicle IsolationFollicle EncapsulationAlginate BeadsRotating Culture SystemIn Vitro CultureControl GroupMicrogravity Treatment

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Cite This Article
Zhang, S., Wu, Y., Weng, Y., Xu, Z., Chen, W., Zheng, D., Lin, W., Liu, J., Zhou, Y. In Vitro Growth of Mouse Preantral Follicles Under Simulated Microgravity. J. Vis. Exp. (130), e55641, doi:10.3791/55641 (2017).
Download Citation
Reprints and Permissions

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image