JoVE Journal > Developmental Biology
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Results
Discussion
Disclosures
Acknowledgements
Materials
References
עברית

Automatically Generated
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Developmental Biology

במבחנה צמיחה של העכבר זקיקים Preantral תחת Microgravity מדומה

Published: December 17, 2017
doi:
10.3791/55641
, , , , , , , ,
1Reproductive Medicine Center,The First Affiliated Hospital of Wenzhou Medical University, 2Department of Orthopaedics,The Second Affiliated Hospital of Wenzhou Medical University, 3Department of Obstetrics,The First Affiliated Hospital of Wenzhou Medical University, 4School of Laboratory Medicine and Life Science,Wenzhou Medical University, 5School of Pharmaceutical Science,Wenzhou Medical University, 6Stem Cells and Genetic Engineering Group, AgriBioscience Research Centre,Department of Economic Development, Jobs, Transport and Resources, 7Department of Histology and Embryology,Wenzhou Medical University

Summary

טכניקה מאוד מבטיח לייצר רקמות בונה בלי באמצעות מטריצת התרבות תאים במצב microgravity מדומה. באמצעות מערכת תרבות סיבוביים, בדקנו זקיק השחלות הצמיחה וההתבגרות oocyte במונחים של זקיק הישרדות, מורפולוגיה, צמיחה, הפונקציה oocyte תחת התנאי microgravity מדומה.

Abstract

14 בת עכבר רקמות השחלה, preantral זקיקים מבודד אותו בגילאי עכברים היו מודגרות במערכת התרבות microgravity מדומה. אנחנו באופן כמותי העריך זקיק הישרדות, נמדד זקיק ואת oocyte קטרים, ובחן ultrastructure של oocytes מיוצר מן המערכת. נצפו זקיק ירד הישרדות, downregulation של ביטויים של מתרבים תאים אנטיגן גרעיני גורם הבידול גידול 9, כמו אינדיקטורים להתפתחות של תאים granulosa ו- oocytes, בהתאמה, ו oocyte ultrastructural ליקויים בתנאי microgravity מדומה. הגדרת הניסוי microgravity מדומה צריך להיות מותאם כדי לספק מודל לחקירה של המנגנונים המעורבים בהתפתחות oocyte/זקיק במבחנה .

Introduction

במבחנה זקיק השחלות ההתפתחות וההתבגרות oocyte הושגו באמצעות שיטות מסורתיות לתרבות 2-ממדי, כגון על פני השטח של צלחות פטרי, שלושה מטריצה תלת-ממדי (3D), כגון קילוף פלסטיצידיות ו הידרוג1 ,2,3. מערכת תרבות 3D ביעילות מתוחזק זקיקים במבנה דמוי רקמה המשיך את דומה ביטוי גנים פרופילים כמו ויוו4 זקיקים ו מיוצר מוכשר meiotically oocytes5,6. ניתן גם להקים מערכות התרבות 3D במצב ללא מטריצה, לדוגמה, תלויות זרוק ההשעיה וכלי מתגלגל. הכלי קיר מסתובב (RWV) שפותח על ידי הלאומית לאווירונאוטיקה החלל נאס א יוצר microgravity מדומה (s-ממוצעg) עבור התאים תרבותי בתוך כלי7. Microgravity מדומה זה תנאי מספק מערכת התרבות הייחודית של התפשטות תא ובידול בשל היעדר משקעי סחף עבור הסעת חום. הוכח כי microgravity מדומה קידום אנדותל כלי היווצרות8,תאי אנדותל9, רקמת בלוטת התריס בהרכבת התריס תאים10, ואת chondrogenesis של שומן, נגזר גזע mesenchymal מכשירים RWV11. עם זאת, מחקרים אחרים הראו כי מדומה microgravity הנוצרות על ידי אפופטוזיס בתאים קיבה B lymphoblasts12,13,14, רומז ההשפעות של הדמיה microgravity על פציעה הסלולר יכול להיות הסלולרי תלויי-סוג. Microgravity מדומה גם לגרום לשינויים ברמת ultrastructural, כפי שדווח בארגון פלך מופרע, המושרה cytoplasmic blebbing oocytes15. התנאים microgravity מדומה ממוטב ואת המנגנונים לגרום פציעות הנדסה או סלולר רקמות תחת המערכת דורשים בהמשך החקירה. ניסויים במבחנה של גידול השחלות זקיקים/oocytes באמצעות מכשירי RWV יכול לספק מידע רב ערך על ביטויים ג’ין oocyte ואת ultrastructures של oocyte organelles. במחקר זה, רקמות השחלה המכילה זקיקי preantral, מבודד זקיקים preantral שימש לחקור את ההשפעות של microgravity מדומהעל התבגרות ופיתוח oocyte זקיק.

במחקר זה, רקמות השחלה המכילה זקיקי preantral, מבודד זקיקים preantral שימשו כדי לחקור את ההשפעות של microgravity מדומה על התבגרות ופיתוח oocyte זקיק. במחקר שלנו, RWV, מכשיר microgravity מדומה, ספינים סביב ציר אופקי בתוך חממה2 CO 5%, מתן תנאי microgravity מדומה עם חמצון יעיל, גזירה נמוכה מאוד. אנחנו נותחו הביטויים ג’ין מתרבים תאים גרעיניים אנטיגן (PCNA), צמיחה בידול פקטור 9 (GDF-9) אינדיקטורים להתפתחות של תאים granulosa ו- oocytes, בהתאמה. הפגנו כי ביטויים PCNA ו GDF-9 דוכאו granulosa תאים, oocytes, בהתאמה, כאשר תרבותי את ההתקן RWV, אנחנו הראו הנסיגה של oocyte microvilli מ- pellucida סונה זקיקי תרבותי תחת s-ממוצע g מצב, שבו היה דומה לזה זקיקים העכבר GDF חשוכת-916.

Protocol

אישור אתיות במחקר זה הושג מהמכללה חיה מחקר אתיקה הוועדה של וון ג’ואו רפואי. 1. הכנת Alginate הידרוג ומדיה תרבות להכין רקמות השחלה בינוני זקיק טיפול באמצעות L-15 בינוני עם סרום שור עוברית 10% 100 IU/mL פניצילין, סטרפטומיצין µg/mL 100. לאחסן ב 4 מעלות צלזיוס למשך שבועיים. הכינו רקמות השחלה ואת זקיק תרבות בינוני המורכב בינוני אלפא-מינימלי הכרחי [α-מ] בתוספת 5% סרום שור בעובר [FBS], 1% אינסולין-סלניום-transferrin 10 mIU/ml rFSH, 100 IU/mL פניצילין, µg 100/mL סטרפטומיצין. לאחסן ב 4 מעלות צלזיוס למשך שבועיים. להכין הידרוג alginate באמצעות פתרון alginate נתרן 0.8% (w/v) ב- PBS סטרילי, ואז ננחת µL 10 של פתרון זה הפתרון כימוס (NaCl /50 מ”מ 140 מ”מ CaCl2) כדי ליצור קילוף פלסטיצידיות חרוזים.הערה: גודל חרוז alginate היה בערך 3 מ מ קוטר. 2. עכבר בידוד זקיק וכימוס ללקט עכברים הנשי ICR בת 14 על ידי נקע בצוואר הרחם, השחלות הסר גילוח ורחיצה כירורגית באמצעות מלקחיים ומספריים, להכניס השחלות 2 מ”ל של טיפול בינוני. לחצי השחלות באמצעות אזמל. רקמת השחלה בגודל חצי היה כ 1 מ מ עובי לתרבות במדיום תרבות. באופן ידני לבודד את זקיקי השחלה באמצעות מחטים 26 1/2-מד תחת stereomicroscope X 2-4, ולאסוף את הזקיקים הנבחרים לתרבות במדיום תרבות.הערה: זקיק קריטריוני בחירה: 1) זקיקים היו עגולות עם oocytes באמצע ו 2-3 שכבות של תאים granulosa המקיפים את oocytes, 2) זקיקים היו של קרום הבזליים שלמות המצורפת עם כמה תאי theca, גודל זקיק 3) היה 90-100 מיקרומטר בקוטר ליצור קילוף פלסטיצידיות חרוזים לכל שלב 1.3. לשטוף את זקיקי alginate פתרון, אז pipette זקיק אחד לאמצע כל חרוז alginate לוודא שכל חרוז מכילה זקיק אחד תחת stereomicroscope. לאחר שטיפה במדיום תרבות, תרבות קילוף פלסטיצידיות חרוזים ב 150 µL של תרבות במדיום × 35 10 מ מ תרבות מאכל או התקן RWV. 3. השחלה או תרבות זקיק תחת Microgravity מדומה להשתמש בהתקן RWV ליצירת microgravity מדומה. למלא את הכלי עם שמן פראפין קל (~ 10 מ”ל), מקום µL 150 של תרבות בינוני droplet לתוך השמן ולאחר מכן להעביר חתיכה אחת של רקמות השחלה או שלושה חרוזים alginate עם זקיקי שעברו אנקפסולציה לתוך ה-droplet בינוני. לסגור את הכובע יציאת ספינת ולתקן את הכלי על גבי בסיס מסתובב של המכשיר. בשליטה קבוצות, הצב חרוזים alginate המכילה זקיקי או רקמות השחלה לתוך µL 150 של תרבות במדיום droplet מכוסה בשמן פרפין אור 35 × מנות תרבות של 10 מ מ. דגירה של תרבות מנות וגם במכשיר RWV חממה humidified ב 37 ° C עם 5% CO2 באוויר. כדי לשנות את התרבות בינוני במכשיר RWV: שופכים את השמן ואת בינוני מכלי הקיבול לתוך 150 × 20 מ מ לצלחת תרבות, להעביר את החרוזים השחלות של רקמות או קילוף פלסטיצידיות לצלחת תרבות תרבות בינונית. ליצור מחדש מערכת התרבות כלי לכל שלב 3.1. 4. decapsulation ואחזור זקיק לאחר 4 ימי culturing, שופכים את השמן ואת בינוני מכלי הקיבול לתוך 150 × 20 מ מ לצלחת תרבות. להרים decapsulate זקיקי החרוזים alginate ושרשרות alginate מאת המקננת בטיפול בינוני בתוספת 10 lyase alginate U/mL עבור 30 דקות ב- 37 מעלות צלזיוס. לאסוף את זקיקי ולאחר מכן לשטוף אותם בטיפול בינוני תחת stereomicroscope. 5. רקמות השחלה והערכה זקיק תא הכדאיות Assay לשטוף את הזקיקים decapsulated שלוש פעמים ב D-PBS ולאחר מכן דגירה אותם ב- 150 µL של ריאגנטים Assay הכדאיות תא משולב (2 מיקרומטר calcein AM ו- 4 מיקרומטר EthD-1) בטמפרטורת החדר למשך 45 דקות. העברת זקיקים לשקופית מיקרוסקופ נקי עם 10 µL D-PBS, לכסות עם coverslip ולאחר מכן אטמו עם לק. ברור. ספירת ירוק, כדוריות אדומות בשקופיות תחת מיקרוסקופ קונפוקלי קרינה פלואורסצנטית (400 X).הערה: זו assay הכדאיות, תאים ירוק הם תאים חיים, כדוריות אדומות תאים מתים. זקיקים עם כדוריות אדומות פחות מ- 10% (המלח) נחשבים זקיקים שרד. Hematoxylin ואאוזין (H & E) צביעת רקמות השחלה ואת זקיק תיקון העכבר בת 14 יום טריים השחלות זקיקים preantral מבודד עכברים בת 14 יום בפתרון של Bouin כדוגמאות יום 0. לתקן את רקמת השחלה בתרבית לאחר יומיים או 4 ימים, ותרבות זקיקים בודדים בתוך החרוזים alginate לאחר 4 ימים תרבות כדוגמאות ניסיוני. להטביע כל דוגמאות פרפין, סעיף באופן סדרתי על עובי 5 מיקרומטר, ואת כתם אז עם H & E בהתאם להוראות היצרן. זקיק ספירה ומדידה קוטר בסעיפים רקמות השחלה מוכתם H & E, לספור כל הזקיקים, בריאים preantral זקיקים בתוך אזור סעיף רקמה במיקרוסקופ (הגדלה 400 X). חישוב צפיפות זקיק על-ידי חלוקת מספר זקיקים preantral על ידי המספר הכולל של זקיקים.הערה: זקיקי preantral בריא הם אלה לפחות שתי שכבות של תאים granulosa. קוטר זקיק ואת oocyte מידה של זקיקים יום 0 ו- 4 יום תרבותי זקיקים. אימונוהיסטוכימיה לתקן את רקמת השחלה paraformaldehyde 4%, להטביע פרפין, סעיף ב 5-מיקרומטר-עובי, והר מקטעי רקמת בשקופיות. Dewax הסעיפים, נוזלים, דגירה אותם במאגר ציטראט במשך 15 דקות לחסום את peroxidase אנדוגני ב 3% חמצן, לחשוף אנטיגן בנסיוב עיזים 5% ואת דגירה ואז עם נוגדנים העיקרי בטמפרטורת החדר במשך 3 שעות. לרחוץ ב- PBS למשך 3 דקות, ואז דגירה של השקופיות עם peroxidase חזרת שבערך מדולל (HRP)-מצומדת עז ארנב אנטי איג (H + L) לשעה בטמפרטורת החדר.הערה: נוגדנים העיקרי השתמשו במחקר היו נוגדנים anti-GDF-9 הארנב (דילול שבערך) נוגדן anti-PCNA הארנב (דילול 1:200). דגירה סעיף השחלות שקופיות עם 3, 3′-Diaminobenzidine [DAB] כדי לזהות את פעילות peroxidase ו הר בשקופיות זכוכית מימית הרכבה בינונית. להתבונן סעיף השחלות שקופיות תחת מיקרוסקופ בהגדלה X 400. במיקרוסקופ אלקטרונים הילוכים [TEM] לתקן את זקיקי גלוטראלדהיד 2.5% עבור 3 שעות בטמפרטורת החדר ולאחר מכן פוסט-לתקן 1% אוסמיום ארבע-חמצני עבור h 1-37 מעלות צלזיוס.לשטוף עם PBS, ואז טפלו זקיקי עם חומצה phosphotungstic 1%, 1% סודיום אצטט uranyl עבור 1 h-37 מעלות צלזיוס. מייבשים זקיקים באמצעות סדרות אצטון: 25, 50, 75, 95, ו 100% (פי 3) ותערובת אצטון שרף אפוקסי לאחר אצטון 100% הסופי צעד ב 37 ° C ולאחר מכן הטבע בשרף אפוקסי ב 45 º C. חותכים את מוטבע למקטעים 1.0 מיקרומטר למחצה דק, כתם הסעיפים עם 1% כחול מתילן למשך 1-2 דקות להתאים לשפה זקיקי ב גושי. חותכים את מוטבע 50 ננומטר ודק במיוחד חלקים והר הסעיפים על רשתות עבור TEM. 6. ניתוח סטטיסטי הצגת כל הנתונים בתבנית זאת אומרת ± SEM. לקבוע שההבדלים בין הקבוצות על ידי ניתוח חד-כיווני השונות (ANOVA) ואחריו Tukey מבחן השוואה מרובים. הסף α בדיקת תוצאות מובהקות הוגדר ב- p < 0.05.

Representative Results

איור 1A מציג את RWV עם שמן בתוך הכלי. Droplet של 150 בינוני µL המכיל חתיכה אחת של רקמות השחלה או שלושה חרוזים alginate עם זקיקי שעברו אנקפסולציה היה לשים לתוך השמן. ה-droplet בינוני נשמר במצב של מהירות עקב לגרור את הנוזלים על טיפות בתוך השמן מסתובב בקצב של 25 סיבובים לדקה, אשר נוצר מצב מדומה microgravity (s-ממוצעg). בניסוי שליטה, רקמות השחלה או capsulated זקיקים היו תרבותי ב- droplet של 150 בינוני µL מכוסה שמן מינרלי ב 35 × 10 מ מ מנות (איור 1B), אשר נוצר 1 – תנאיg . כדי לחקור את ההשפעות של microgravity מדומה על זקיק preantral לפיתוח במבחנה, אנחנו תרבותי רקמת השחלה העכבר בת 14 תחת 1 -g (בקרת הניסוי) או s-µg תנאים. ספרנו את המספר של זקיקי שיער בריא ב- H & E צבעונית ובסעיף שני תנאים לאחר 0, 2, ו- 4 ימים של תרבות (איור 2). מצאנו כי ההישרדות זקיק ברקמת השחלה מטופלים במצבg s-ממוצע היה נמוך באופן משמעותי מזה תחת 1 – תנאיg יום שני ו יום 4 culturing (p < 0.05, ANOVA). יתר על כן, מצאנו כי אין PCNA חיובי אותות התגלו ברקמת השחלה תחת התנאיg s-ממוצע (איור 3). בתרבות של זקיקים preantral מבודדים במארז alginate חרוזים, חשפנו כי באופן משמעותי יותר זקיקים שרד תחת 1 – תנאיg (± 76.8% 5.3%, n = 227) מאשר תנאיg s-ממוצע (54.4% ± 6.7%, n = 249) ביום 4 של culturing . בנוסף, גודל oocyte אין עלייה משמעותית לאחר 4 ימים culturing, אבל היה הזקיק בגודל גדל באופן משמעותי בתנאים הכבידה שני (איור 4). עם זאת, זקיקי עם תאים מתים granulosa פחות מ- 10% (איור 5) היו נמוכים משמעותית תחת 1 -g תנאי (81.5 ± 5%, n = 10) מאשר בתנאיg s-ממוצע (90 ± 8%, n = 10) (p < 0.05). כדי לחקור את ההשפעות של microgravity מדומה על פונקציונליות oocyte, בדקנו את הביטוי של דה מרקר oocyte ספציפיים GDF-9. להדגים כי הביטוי GDF-9 היה להפליא למטה מוסדר בתוך רקמת השחלה בתנאיg s-ממוצע (איור 6). בנוסף, אנחנו הפגינו העיוותים בתדירות גבוהה ultrastructural של organelles oocyte בתוך זקיקי שעברו אנקפסולציה ביום 4 של תרבות תחת התנאיg s-ממוצע (איור 7). איור 1 : כיוונון של s -ממוצעg ו- 1-g תרבות תנאים. (א) s-ממוצעg נוצר על ידי סיבוב קיר הספינה ועל שמירה על הנושאים תרבות במצב של נפילות קבוע בתוך השמן נע. (B) א 1 -g מצב נוצר על ידי culturing רקמות השחלה או זקיקי על פני צלחת פטרי מכוסה שמן מינרלי. החץ מצביע על droplet של מדיום. סרגל קנה מידה = 1 ס מ. איור זה שונה מג’אנג. et al. 17 אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת. איור 2 : ההשפעות של s-µg על תרבות רקמת השחלה. (א) סעיפים של רקמת השחלה בתרבית תחת 1 -g או s-ממוצעg תנאים 0, 2, ו- 4 ימים. סרגל קנה מידה = 50 זקיק צפיפות מיקרומטר. (B) בסעיפים רקמות השחלה. שגיאה בר מייצג 1 SEM, *: p < 0.05. איור זה שונה מג’אנג. et al. 17 אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת. איור 3 : אימונוהיסטוכימיה של PCNA. ביטוי חלבון PCNA נבחנה בתאים granulosa ברקמת השחלה בתרבית תחת 1 -g או s-ממוצעg תנאים 0, 2, ו- 4 ימים. סרגל קנה מידה = 50 מיקרומטר. איור זה שונה מג’אנג. et al. 17 אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת. איור 4 : השפעות של s-ממוצעg על התרבות של זקיקי preantral שעברו אנקפסולציה alginate חרוזים. מורפולוגיה (A) של זקיקים preantral בתרבית תחת 1 -g או s-ממוצעg תנאים במשך 4 ימים 0. סרגל קנה מידה = 50 מיקרומטר (B) Oocyte בקוטר ו- (ג) קוטר הזקיק הושוו בין 1 g ותנאיםg s-ממוצע. שגיאה בר מייצג 1 SEM, *: p < 0.05. איור זה שונה מג’אנג. et al. 17 אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת. איור 5 : Assay הכדאיות תא. נציג תמונות נלקחו תחת מיקרוסקופ בהגדלה X 400. השימושים assay Calcein AM להמחיש תאים חיים מוכתם בירוק, EthD-1 כדי להמחיש את הגרעינים של תאים מתים מוכתם באדום. (א): זקיק עם תאים granulosa בשידור חי ~ 100% (ירוק). (B): זקיק עם תאים granulosa בשידור חי (ירוק), כמו גם יותר מ- 10% תאים מתים (אדום). סרגל קנה מידה = 50 מיקרומטר.איור זה שונה מג’אנג. et al. 17 אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת. איור 6 : אימונוהיסטוכימיה GDF-9- ביטוי חלבון GDF-9 נבחנה ב oocytes בתוך רקמת השחלה בתרבית תחת 1 -g או s-ממוצעg תנאים 0, 2, ו- 4 ימים. סרגל קנה מידה = 50 מיקרומטר. איור זה שונה מג’אנג. et al. 17 אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת. איור 7 : ניתוח ultrastructural של זקיקים preantral מבודד תרבותי תחת 1 – g או s-ממוצע g תנאים ביום 4 של תרבות. (א) oocyte עם microvilli (חיצים) לעומק pellucida zona (1 -g מצב). (B-F) Oocytes עם וקואלות גדולים (*), גופים multilamellar (#), טיפות השומנים (חיצים), המיטוכונדריה vacuolated חסר cristae (חץ), ופיזור מערכת גולג’י (חץ), בהתאמה (תנאיg s-ממוצע). O: oocyte; מסוג ZP: zona pellucida. איור זה שונה מג’אנג. et al. 17 אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Discussion

השלבים הקריטיים עבור culturing מוצלחת של זקיקים preantral הם: 1) כראוי בחירת הזקיקים preantral על פי הקריטריונים לבחירת שתוארו פרוטוקול טקסט 2.1); 2) preforming בכל ההליכים במצב ספקן ושמירה על תרבות סטרילית; ו 3) כראוי הגדרת מערכת התרבות RWV.

שמירה על עקביות של תצפיות ניסיוני בניסויים שכפל הוא להשתמש בחומרים דומים או זהים. הקריטריונים לבחירה של זקיקים preantral העכבר חשף כי זקיקי היה 1) oocytes בריא בשלב התמוטטות (GVBD) שלפוחית germinal מוקף pellucida zona דק; 2) 2-3 שכבות של תאים granulosa התחומה על ידי קרום הבסיס; ו 3) כמה תאים thecal המצורפת קרום הבסיס. לפיכך, זקיקי שנבחר היה לא רק כל שלושה תאי פונקציונלי זקיק השחלות לתמיכה oocyte צמיחה, אלא גם על זיהוי מורפולוגי דומה בקוטר של 90-100 מיקרומטר.

זה הניסיון הראשון לגדול זקיקים preantral העכבר בצורה של תלת-ממד culturing תחת microgravity מדומה. מספר מערכות תרבות התפתחו זקיקים preantral העכבר. Oocytes המתקבל זקיק תרבותי על משטח שטוח של צלחות פטרי, תרבות 2D כביכול, יכול להיות מופרית והפיק הצאצאים בשידור חי. יתר על כן, תרבויות תלת-ממד, כגון תרבויות של זקיקי alginate חרוזים, לשמור על מבנה רקמת הדומה מה הגוף מייצר, oocytes המוסמכים meiotically אחוז גבוה. עם זאת, תהליך הפיתוח של השחלות זקיקים oocytes בשדה כבידה אינו ידוע. RWV, מכשיר אשר מושך תשומת לב רבה בהנדסת רקמות, באפשרותך ליצור סביבה microgravity מדומה ולספק סביבה אידיאלית עבור חוקרים את ההשפעות של microgravity מדומה על הצמיחה זקיק השחלות/oocytes במבחנה.

חשוב להגדיר את המנגנון RWV כראוי עבור תרבית תאים. יש להסיר את בועות האוויר בתוך הכלי. השיטה כדי להסיר בועות אוויר, אם נוצר בתוך הכלי, היא כדלקמן: הכנס כל אחד הנמלים מזרק שני שני מזרקים עם 0.5 מ של שמן. פתח את השסתומים שליטה היציאות מזרק. לתמרן בועות אוויר מתחת הנמל מזרק. למשוך את הבועות לתוך המזרק תוך הזרקת באותו אמצעי אחסון של מדיה דרך היציאה מזרק אחרים. לאחר כל הבועות יוסרו, לסגור את השסתומים, להסיר את? המזרקים ולהחליף את הפקקים יציאת מזרק. חשוב גם לברר את מהירות הסיבוב הנכון, אשר מונע תאים ליישב באמצעות סיבוב מתמיד. אופטימיזציה של מהירות סיבוב נקבעת לפי המשקל הסגולי של התאים, צפיפות נוזל צמיגות.

פרופילי ביטוי PCNA ו GDF-9, אשר היו דומות לאלה חשוכת-9-GDF העכבר זקיקים16, גילה microgravity המדומה הזה היו השפעות מזיקות על הפיתוח של תאים granulosa ושל oocytes. הכלי של המכשיר RWV שסובב סביב ציר אופקי פנימה חממה2 CO 5%, המאפשר הסתננות של חמצן, פחמן דו-חמצני על פני קרום מאחור, מתן חמצון יעיל גזירה נמוך מאוד, אשר היה לא צפוי להיות לגרום לפגיעה oocyte/זקיק. אופטימיזציה של הגדרת הניסוי וניתוחים נוספים יש צורך לחקור את המנגנון של השפעות מזיקות.

מחקרים נוספים דרושים כדי לחקור את הפוטנציאל ההתפתחותי של oocytes במבחנה נגזר מערכת התרבות RWV. כיום מתבצעת ההבשלה במבחנה של oocytes לשלב MII. האימות הסופי של מערכת תרבות זו ייבחנו על ידי הפריה מקיבולת oocytes שאוחזרו.

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

המחברים רוצה להודות Yilong וואנג, אלחנן בטאט זאו לסיוע שלהם בשמירה על החיות, ג’אנג צ’אן על הסיוע בהכנת הדגימות היסטולוגית, ד ר Songtao הוא ביקורתי קריאת כתב היד הזה. עבודה זו נתמכה על ידי קרן מדעי הטבע של פרובינציית Zhejiang (להעניק את המספר: LY13C120002).

Materials

ICR mice SLRC Laoratory 14-day-old female mice
L-15 medium Sigma L1518 With L-glutamine, liquid, sterile-filtered, suitable for cell culture
fetal bovine serum Gibco 10100147 Origin: Australia
Penicillin V potassium Sigma 1504503 United States Pharmacopeia (USP) Reference Standard (USP)
Streptomycin sesquisulfate hydrate Sigma 46754 Analytical standard
Universal Click Pen Needles Penfine 12×1/2" 0.33×12 mm
Alginate Sigma W201502
alpha-minimal essential medium Sigma M0894 Alpha Modification, with L-glutamine, without ribonucleosides, deoxyribonucleosides and sodium bicarbonate, powder, suitable for cell culture
Insulin-selenium-transferrin Invitrogen 51500056 Liquid, sterile-filtered, BioReagent, suitable for cell culture
GONAL-F Merck Serono Recombinant follitropin alfa for injection
Disposable high-aspect-ratio rotating vessel Synthecon 10 mL
Culture oil Vitrolife Sterile light paraffin oil
Alginate Lyase Sigma A1603 powder, >10,000 units/g solid
26 1/2-guage needle Becton Dickinson
35×10mm dish Becton Dickinson
Viability/Cytotoxicity assay Kit Invitrogen L3224
Bouin’s solution Sigma HT10132
Horseradish peroxidase (HRP)-conjugated goat anti-rabbit IgG (H+L) Jackson Immuno-Research Laboratories 111-035-003
3,3N-Diaminobenzidine Tertrahydrochloride Beyotime P0203
Aqueous mounting medium Dako C0563
Rabbit anti-GDF-9 antibody Beijing Biosynthesis Biotechnology BS-175R
Rabbit anti-PCNA antibody Proteintech 24036-1-AP
Methylene blue Sigma M9140
Transmission electron microscope Hitachi H-7500
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Eppig, J. J., Schroeder, A. C. Capacity of mouse oocytes from preantral follicles to undergo embryogenesis and development to live young after growth, maturation, and fertilization in vitro. Biol Reprod. 41, 268-276 (1989).
  2. O’Brien, M. J., Pendola, J. K., Eppig, J. J. A revised protocol for in vitro development of mouse oocytes from primordial follicles dramatically improves their developmental competence. Biol Reprod. 68, 1682-1686 (2003).
  3. Liu, J., Van der Elst, J., Van den Broecke, R., Dhont, M. Live offspring by in vitro fertilization of oocytes from cryopreserved primordial mouse follicles after sequential in vivo transplantation and in vitro maturation. Biology of Reproduction. 64, 171-178 (2001).
  4. Parrish, E. M., Siletz, A., Xu, M., Woodruff, T. K., Shea, L. D. Gene expression in mouse ovarian follicle development in vivo versus an ex vivo alginate culture system. Reproduction. 142, 309-318 (2011).
  5. Xu, M., Kreeger, P. K., Shea, L. D., Woodruff, T. K. Tissue-engineered follicles produce live, fertile offspring. Tissue Eng. 12, 2739-2746 (2006).
  6. Xu, M., West, E., Shea, L. D., Woodruff, T. K. Identification of a stage-specific permissive in vitro culture environment for follicle growth and oocyte development. Biol Reprod. 75, 916-923 (2006).
  7. Grimm, D., et al. Growing tissues in real and simulated microgravity: new methods for tissue engineering. Tissue engineering. Part B, Reviews. 20, 555-566 (2014).
  8. Grimm, D., et al. Different responsiveness of endothelial cells to vascular endothelial growth factor and basic fibroblast growth factor added to culture media under gravity and simulated microgravity. Tissue engineering Part A. 16, 1559-1573 (2010).
  9. Grimm, D., et al. A delayed type of three-dimensional growth of human endothelial cells under simulated weightlessness. Tissue engineering. Part A. 15, 2267-2275 (2009).
  10. Pietsch, J., et al. Interaction of proteins identified in human thyroid cells. International journal of molecular sciences. 14, 1164-1178 (2013).
  11. Yu, B., et al. Simulated microgravity using a rotary cell culture system promotes chondrogenesis of human adipose-derived mesenchymal stem cells via the p38 MAPK pathway. Biochem Biophys Res Commun. 414, 412-418 (2011).
  12. Maier, J. A., Cialdai, F., Monici, M., Morbidelli, L. The impact of microgravity and hypergravity on endothelial cells. Biomed Res Int. 2015, 434803 (2015).
  13. Zhu, M., Jin, X. W., Wu, B. Y., Nie, J. L., Li, Y. H. Effects of simulated weightlessness on cellular morphology and biological characteristics of cell lines SGC-7901 and HFE-145. Genet Mol Res. 13, 6060-6069 (2014).
  14. Dang, B., et al. Simulated microgravity increases heavy ion radiation-induced apoptosis in human B lymphoblasts. Life Sci. 97, 123-128 (2014).
  15. Wu, C., et al. Simulated microgravity compromises mouse oocyte maturation by disrupting meiotic spindle organization and inducing cytoplasmic blebbing. PLoS One. 6, e22214 (2011).
  16. Dong, J., et al. Growth differentiation factor-9 is required during early ovarian folliculogenesis. Nature. 383, 531-535 (1996).
  17. Zhang, S., et al. Simulated Microgravity Using a Rotary Culture System Compromises the In Vitro Development of Mouse Preantral Follicles. PLoS One. 11, e0151062 (2016).

Tags

Mouse Preantral FolliclesIn Vitro GrowthSimulated MicrogravityFollicle IsolationFollicle EncapsulationAlginate BeadsRotating Culture SystemIn Vitro CultureControl GroupMicrogravity Treatment

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Cite This Article
Zhang, S., Wu, Y., Weng, Y., Xu, Z., Chen, W., Zheng, D., Lin, W., Liu, J., Zhou, Y. In Vitro Growth of Mouse Preantral Follicles Under Simulated Microgravity. J. Vis. Exp. (130), e55641, doi:10.3791/55641 (2017).
Download Citation
Reprints and Permissions

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image