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Developmental Biology

In-vitro- Wachstum der Maus Preantral Follikel in simulierter Schwerelosigkeit

Published: December 17, 2017
doi:
10.3791/55641
, , , , , , , ,
1Reproductive Medicine Center,The First Affiliated Hospital of Wenzhou Medical University, 2Department of Orthopaedics,The Second Affiliated Hospital of Wenzhou Medical University, 3Department of Obstetrics,The First Affiliated Hospital of Wenzhou Medical University, 4School of Laboratory Medicine and Life Science,Wenzhou Medical University, 5School of Pharmaceutical Science,Wenzhou Medical University, 6Stem Cells and Genetic Engineering Group, AgriBioscience Research Centre,Department of Economic Development, Jobs, Transport and Resources, 7Department of Histology and Embryology,Wenzhou Medical University

Summary

Eine vielversprechende Technik, um Gewebe zu generieren baut ohne Verwendung von Matrix an Zellkulturen in simulierter Schwerelosigkeit Zustand ist. Mit einem rotierenden Kultursystem, untersuchten wir Wachstum der Follikel und Eizellreifung Follikel überleben, Morphologie, Wachstums-und Eizelle Funktion unter der Bedingung der simulierten Schwerelosigkeit.

Abstract

14 Tage alte Maus Eierstockgewebe und preantral Follikel isoliert vom gleichen Alter Mäuse wurden in einer simulierten Schwerelosigkeit Kultursystem inkubiert. Wir quantitativ bewertet Follikel überleben, gemessenen Follikel und die Eizelle Durchmessern und Ultrastruktur der Eizellen produziert aus dem System zu prüfen. Wir beobachteten verminderte Follikel überleben, Herabregulation der Ausdrücke wuchernden cell nuclear Antigen und Differenzierung Wachstumsfaktor 9, als Indikatoren für die Entwicklung von Granulosa Zellen und Eizellen, bzw., und Eizelle Ultrastrukturforschung Abweichungen unter der Bedingung der simulierten Schwerelosigkeit. Die simulierte Schwerelosigkeit Versuchsaufbau muss optimiert werden, um ein Modell für die Untersuchung der Mechanismen der Eizelle/Follikel in-vitro- Entwicklung anbieten.

Introduction

In-vitro- Follikel Entwicklung und Eizellreifung erzielt werden mit traditionellen Methoden für die 2-dimensionale Kultur, wie z. B. auf der Oberfläche der Petrischalen und drei dimensionale (3D) Matrix, z. B. Alginat und Hydrogel1 ,2,3. Ein 3D Culture-System effektiv Follikel in einem Gewebe-artige Struktur beibehalten und ähnliche gen Ausdruck Profile als in Vivo4 Follikel gehalten und produziert meiotically zuständigen Eizellen5,6. 3D Culture-Systeme auch in einem Matrix-freie Zustand hergestellt werden können, z. B. hängenden Tropfen Federung und rollenden Schiffe. Das rotierende Wand Schiff (RWV) entwickelt von der National Aeronautics and Space Administration (NASA) erzeugt ein simulierter Schwerelosigkeit (s-µg) für die Zellen im Inneren des Schiffes7kultiviert. Diese simulierten Schwerelosigkeit Zustand bietet eine einzigartige Kultur-System für Zell-Proliferation und Differenzierung wegen des Mangels an Sedimentation für Konvektion. Es hat sich gezeigt, dass simulierte Schwerelosigkeit endotheliale Schiff-Formation von Endothelzellen8,9, Schilddrüsengewebe Montage aus Schilddrüse Zellen10und von Fettgewebe abgeleitet werden gefördert mesenchymale Stammzellen in RWV Geräte11. Andere Studien haben jedoch gezeigt, dass simulierter Schwerelosigkeit Apoptose in Magen-Zellen induziert und B Lymphoblasts12,13,14, was auf die Auswirkungen der Schwerelosigkeit auf zellulärer Verletzung simuliert möglicherweise Zelle typabhängig. Simulierter Schwerelosigkeit könnte auch Veränderungen auf der Ultrastrukturforschung Ebene wie in der gestörten Spindel-Organisation berichtet und zytoplasmatischen Blebbing Eizellen15induziert. Die optimierte simulierten Mikrogravitation und Mechanismen, die unter dem System engineering oder zellulären Gewebeverletzungen induzieren weitere Untersuchungen nötig machen. In-vitro- Experimente der wachsenden ovariellen Follikel/Eizellen mit RWV Geräten können wertvolle Informationen über Eizelle gen Ausdrücke und Feinstrukturen der Eizelle Organellen. In dieser Studie Eierstockgewebe mit preantral Follikel und isolierte preantral Follikel wurde verwendet, um die Auswirkungen der simulierten Schwerelosigkeit untersuchenauf Entwicklung und Eizelle Follikelreifung.

In dieser Studie Eierstockgewebe mit preantral Follikel und isolierte preantral Follikel wurden verwendet, um die Auswirkungen der simulierten Schwerelosigkeit auf Entwicklung und Eizelle Follikelreifung zu untersuchen. In unserer Studie, RWV, bietet eine simulierter Schwerelosigkeit Gerät, Drehungen um eine horizontale Achse in eine 5 % CO2 Brutmaschine ein simulierter Schwerelosigkeit Zustand mit effiziente Oxygenierung und sehr geringen Schubspannung. Wir analysieren die gen-Ausdrücke der wuchernden Cell nuclear Antigen (PCNA) und Differenzierung Wachstumsfaktor 9 (GDF-9) als Indikatoren für die Entwicklung von Granulosa Zellen und Eizellen, bzw.. Wir bewiesen, dass PCNA und GDF-9 Ausdrücke in die Granulosa Zellen und Eizellen, bzw. unterdrückt wurden, wenn im RWV Gerät kultiviert, und wir den Rückzug der Eizelle Mikrovilli aus der Zona Pellucida in den Follikeln kultiviert unter der s-µ zeigten g Zustand, der sich ähnlich wie in GDF-9-defizienten Maus Follikel16war.

Protocol

Ethischen Zustimmung für diese Studie wurde vom Tier Forschung Ethik Komitee von Wen Zhou Medical College. 1. Vorbereitung von Nährmedien und Alginat Hydrogel Bereiten Sie Eierstockgewebe und Follikel Handhabung Medium mit L-15 Medium mit 10 % fötalen Rinderserum, 100 IU/mL Penicillin und 100 µg/mL Streptomycin. Zwei Wochen lang bei 4 ° C lagern. Bereiten Eierstockgewebe und Follikel Kulturmedium bestehend aus Alpha-minimal wesentliche Medium [α-MEM] ergänzt mit 5 % fötalen Rinderserum [FBS], 1 % Insulin-Selen-Transferrin, 10 mIU/ml rFSH 100 IU/mL Penicillin und 100 µg/mL Streptomycin. Zwei Wochen lang bei 4 ° C lagern. Bereiten Sie Alginat Hydrogel mit 0,8 % (w/V) Natriumalginat Lösung in sterilen PBS vor, dann fallen Sie 10 µL dieser Lösung in die Kapselung-Lösung (140 mM NaCl 50 mM CaCl2) Alginat Perlen zu erstellen.Hinweis: Die Alginat-Perle-Größe war ca. 3 mm im Durchmesser. (2) Maus Follikel Isolierung und Kapselung 14 Tage alte ICR weibliche Mäusen durch zervikale Dislokation, entfernen Eierstöcke aseptisch mit Schere und Pinzette zu Keulen und 2 mL der Umgang mit Medium Eierstöcke umgesetzt. Geschnitten Sie Eierstöcke in zwei Hälften mit einem Skalpell. Halber Größe Eierstockgewebe war ca. 1 mm Dicke für die Kultur in das Kulturmedium. Manuell isolieren Sie Follikel von Eierstöcken mit 26 1/2-Gauge Nadeln unter einem 2-4 X Stereomikroskop zu, und sammeln Sie die ausgewählten Follikel für Kultur in das Kulturmedium.Hinweis: Follikel Auswahlkriterien: 1) Follikel mit Eizellen in der Mitte und 2-3 Schichten der Granulosa Zellen umgebenden der Eizellen, 2 Runden waren) Follikel hatte eine intakte Basalmembran verbunden mit einigen Theca-Zellen, und (3) Follikel Größe 90-100 µm im Durchmesser Alginat Perlen pro Schritt 1.3 zu erstellen. Follikel mit Alginat Lösung zu waschen und dann pipette eine einzelne Follikel in die Mitte jedes Alginat-Kügelchen, um sicherzustellen, dass jede Perle eine einzelne Follikel unter einem Stereomikroskop enthält. Nach dem Spülen in Kulturmedium, Kultur das Alginat Perlen in 150 µL Kulturmedium in 35 × Kultur 10 mm Teller oder ein RWV Gerät. (3) Eierstockgewebe oder Follikel Kultur in simulierter Schwerelosigkeit Verwenden Sie ein RWV Gerät zur Erzeugung von simulierten Schwerelosigkeit. Befüllen Sie den Behälter mit leichten Paraffinöl (~ 10 mL), 150 µL Kulturmedium in ein Tropfen in das Öl, dann übertragen Sie Einteiler von Eierstockgewebe oder drei Alginat-Perlen mit gekapselten Follikel in der mittleren Tröpfchen. Schließen Sie das Schiff Hafen Cap und beheben Sie das Schiff auf der drehbaren Untergestell des Gerätes zu. Kontrolle Gruppen platzieren Alginat-Perlen, die Follikel enthalten oder Eierstockgewebe in 150 µL Nährmedium in einem Tröpfchen bedeckt mit leichten Paraffinöl in 35 × 10 mm Kultur Gerichte. Inkubieren Sie die Kultur Gerichte und RWV Gerät in einem befeuchteten Inkubator bei 37 ° C mit 5 % CO2 in die Luft. Kulturmedium in RWV Gerät ändern: Gießen Sie das Öl und das Medium aus dem Gefäß in der 150 × 20 mm Kulturschale, der ovariellen Gewebe oder Alginat Perlen auf einer Kulturschale mit Nährmedium übertragen. Wiederherstellen Sie das Gefäßsystem Kultur pro Schritt 3.1. (4) Delamination und Follikel abrufen Gießen Sie nach 4 Tagen der Kultivierung das Öl und das Medium aus dem Gefäß in der 150 × 20 mm Kulturschale. Abholung Alginat Perlen und Decapsulate Follikel aus Alginat Perlen durch Inkubation im Umgang mit Medium ergänzt mit 10 U/mL Alginat Lyase für 30 min bei 37 ° C. Sammeln Sie Follikel zu und dann waschen Sie sie im Umgang mit Medium unter einem Stereomikroskop. (5) Eierstockgewebe und Follikel Bewertung Zelle Lebensfähigkeit Assay Die Decapsulated Follikel dreimal in D-PBS waschen und dann brüten sie in 150 µL der kombinierten Zelle Lebensfähigkeit Assay Reagenzien (2 µM Calcein AM und 4 µM EthD-1) bei Raumtemperatur für 45 Minuten. Follikel zu übertragen, um einen sauberen Objektträger mit 10 µL D-PBS, mit einem Deckglas abdecken, und dann mit klaren Nagellack versiegeln. Graf grün und Erythrozyten in den Folien unter dem konfokale Fluoreszenzmikroskop (400 X).Hinweis: In diesem Assay Lebensfähigkeit grünen Zellen sind lebende Zellen und roten Blutkörperchen sind abgestorbene Zellen. Follikel mit weniger als 10 % Erythrozyten (Toten) gelten als überlebt Follikel. Hämatoxylin und Eosin (H & E) Färbung von Eierstockgewebe und Follikel Befestigen Sie frischen 14-Tag-alte Maus Eierstöcke und preantral Follikel von 14 Tage alte Mäuse in Bouins Lösung als Tag 0 Proben isoliert. Befestigen Sie die kultivierten Eierstockgewebe nach entweder 2 oder 4-Tage Kultur und einzelnen Follikel innerhalb der Alginat-Perlen nach 4 Tage Kultur als experimentellen Proben. Alle Proben in Paraffin, Abschnitt seriell bei 5 µm Dicke, einbetten und dann Flecken mit H & E nach den Anweisungen des Herstellers. Follikel zu zählen und Durchmessermessung Abschnittsweise Eierstockgewebe gebeizt mit H & E, zählen alle Follikel und gesunde preantral Follikel innerhalb der Querschnittsfläche Gewebe unter dem Mikroskop (400 X Vergrößerung). Follikel Dichte zu berechnen, indem die Anzahl der preantral Follikel durch die Gesamtzahl der Follikel.Hinweis: die gesunde preantral Follikel sind mit mindestens zwei Schichten von Granulosa Zellen. Follikel und die Eizelle Durchmesser messen der Follikel Tag 0 und Tag 4 kultiviert Follikel. Immunohistochemistry Fix Eierstockgewebe in 4 % Paraformaldehyd, Einbettung in Paraffin, Abschnitt bei einer 5-µm-Stärke und Gewebeschnitte auf Folien zu montieren. In den Abschnitten Wachsentfernung rehydrieren, brüten sie in Citrat-Puffer für 15 min. Block der endogenen Peroxidase in 3 % Wasserstoffperoxid, Antigen in 5 % Ziegenserum zu entlarven und dann brüten mit Primärantikörpern bei Raumtemperatur für 3 h. Waschen mit PBS-Puffer für 3 min, dann inkubieren Sie die Folien mit 1: 500 verdünnt Meerrettich Peroxidase (HRP)-konjugiert Ziege Anti-Kaninchen IgG (H + L) für 1 h bei Raumtemperatur.Hinweis: Der primäre Antikörper, die in der Studie verwendeten waren Kaninchen Anti-GDF-9 Antikörper (Verdünnung 1: 500) und Kaninchen Anti-PCNA Antikörper (Verdünnung 1: 200). Inkubieren Sie Eierstöcke Abschnitt Folien mit 3, 3′-Diaminobenzidine [DAB] zur Erkennung von Peroxidase-Aktivität und Mount auf Objektträgern mit wässrigen Eindeckmedium. Beobachten Sie Eierstöcke Abschnitt Folien unter dem Mikroskop bei 400 X Vergrößerung. Transmissions-Elektronenmikroskopie [TEM] Follikel in 2,5 % Glutaraldehyd 3 h bei Raumtemperatur zu beheben, dann Post-fix in 1 % Osmium ausgefällt für 1 h bei 37 ° C.Waschen mit PBS, dann behandeln Sie die Follikel mit 1 % Phosphotungstic Acid und 1 % Natriumacetat Uranyl für 1 h bei 37 ° C. Follikel mit einem Aceton-Serie zu entwässern: 25, 50, 75, 95 und 100 % (3 Mal) und Epoxy-Harz-Aceton-Mischung nach der letzten 100 % Aceton Schritt bei 37 ° C, und dann einbetten in Epoxidharz bei 45 ° C. 1,0 µm semi-dünne Abschnitte die eingebetteten Blöcke geschnitten, und Flecken in den Abschnitten mit 1 % Methylenblau für 1-2 min, die Follikel in den Blöcken zu lokalisieren. Schneiden Sie die eingebetteten Blöcke in 50 nm ultradünnen Abschnitte und montieren Sie die Abschnitte auf Gittern für TEM. 6. statistische Analyse Alle Daten in einem Mittelwert ± SEM Format dargestellt. Bestimmen Sie die Unterschiede zwischen Gruppen von Einweg Varianzanalyse (ANOVA), gefolgt von Tukey mehrere Vergleichstest. Die α-Schwelle für Test Ergebnis Bedeutung setzte bei p < 0,05.

Representative Results

Abbildung 1A zeigt einen RWV mit Öl aus dem Inneren des Schiffes. Ein Tröpfchen von 150 µL Medium, ein Stück von Eierstockgewebe oder drei Alginat-Perlen mit gekapselten Follikel enthalten wurde in das Öl genommen. Der mittlere Tropfen blieb in einem Zustand der Endgeschwindigkeit durch die Flüssigkeit ziehen auf die Tröpfchen im rotierenden Öl mit Rate von 25 Umdrehungen pro Minute, die einen simulierter Schwerelosigkeit (s-µg) Zustand erzeugt. In einem Kontrollexperiment Eierstockgewebe oder verkapselte Follikel in einem Tropfen von 150 µL Medium mit Mineralöl in 35 × 10 mm bedeckt kultiviert wurden Gerichte (Abbildung 1 b), die ein 1-erzeugtg Zustand. Zur Untersuchung der Auswirkungen der simulierten Schwerelosigkeit auf preantral Follikel Entwicklung in Vitrokultiviert wir die 14 Tage alte Maus Eierstockgewebe unter 1 -g (Kontrollexperiment) oder s-µg-Bedingungen. Wir zählten die Anzahl der gesunde Follikel in den H & E gebeizt Abschnitte in zwei Bedingungen nach 0, 2 und 4 Tage der Kultur (Abbildung 2). Wir fanden, dass das Follikel überleben im Eierstockgewebe behandelt in der s-µg Zustand deutlich niedriger als die unter 1 -g Zustand am Tag 2 und 4 der Kultivierung (p < 0,05, ANOVA). Darüber hinaus fanden wir, dass keine PCNA positive Signale in der ovariellen Gewebe unter der s-µg Bedingung (Abbildung 3) entdeckt wurden. In der Kultur der isolierten preantral Follikel in Alginat Perlen gekapselt, wir gezeigt, dass deutlich mehr Follikel unter 1 – überlebtg Zustand (76,8 % ± 5,3 %, n = 227) als s-µg Zustand (54,4 % ± 6,7 %, n = 249) am 4. Tag der Kultivierung . Darüber hinaus Eizelle Größe hatte nicht wesentlich erhöhen und nach 4 Tagen der Kultivierung, obwohl die Follikel vergrößert erheblich sowohl Schwerkraft Bedingungen (Abbildung 4). Follikel mit weniger als 10 % tot Granulosa Zellen (Abbildung 5) waren jedoch deutlich unter der 1 -g Zustand (81,5 ± 5 %, n = 10) als unter s-µg Zustand (90 ± 8 %, n = 10) (p < 0,05). Um die Auswirkungen der simulierten Schwerelosigkeit auf Eizelle Funktionalität zu untersuchen, haben wir die Expression von der Eizelle-spezifische Marker GDF-9 untersucht. Wir bewiesen, dass GDF-9 Ausdruck bemerkenswert in der ovariellen Gewebe unter s-µg Zustand (Abbildung 6) nach unten geregelt war. Darüber hinaus haben wir häufige Ultrastrukturforschung Anomalien der Eizelle Organellen in den gekapselten Follikeln am Tag 4 der Kultur unter den s-µg Zustand (Abbildung 7). Abbildung 1 : Einrichtung des s -µg und 1-g Kultur Bedingungen. (A) s-µg entstand durch die Wand Schiff drehen und halten die Kultur-Themen in einem Zustand der ständigen freien Fall innerhalb der beweglichen Öl. (B) A 1 -g Zustand entstand durch Kultivierung Eierstockgewebe oder Follikel auf der Oberfläche einer Petrischale mit Mineralöl gedeckt. Der Pfeil zeigt einen Tropfen des Mediums. Maßstabsleiste = 1 cm. Diese Zahl wurde von Zhang Et Al. modifiziert 17 Klicken Sie bitte hier, um eine größere Version dieser Figur. Abbildung 2 : Auswirkungen von s-µg auf die Eierstöcke Gewebekultur. (A) Abschnitte von Eierstockgewebe kultivierten unter 1g oder s-µg Bedingungen für 0, 2 und 4 Tage. Maßstabsleiste = 50 µm (B) Follikel Dichte in den Abschnitten Ovargewebe. Fehler bar stellt 1 SEM *: p < 0,05. Diese Zahl wurde von Zhang Et Al. modifiziert 17 Klicken Sie bitte hier, um eine größere Version dieser Figur. Abbildung 3 : Immunohistochemistry PCNA. PCNA-Protein-Expression wurde untersucht, in die Granulosa Zellen in der ovariellen Gewebe kultivierten unter 1g oder s-µg Bedingungen für 0, 2 und 4 Tage. Maßstabsleiste = 50 µm. Diese Zahl wurde von Zhang Et Al. modifiziert 17 Klicken Sie bitte hier, um eine größere Version dieser Figur. Abbildung 4 : Auswirkungen von s-µg auf die Kultur der gekapselten preantral Follikel in Alginat Perlen. (A) Morphologie der preantral Follikel kultivierten unter 1g oder s-µg Bedingungen für 0 und 4 Tage. Maßstabsleiste = 50 Eizelle Durchmesser µm. (B) und (C) Follikel wurden zwischen 1 g und s-µg Bedingungen verglichen. Fehler bar stellt 1 SEM *: p < 0,05. Diese Zahl wurde von Zhang Et Al. modifiziert 17 Klicken Sie bitte hier, um eine größere Version dieser Figur. Abbildung 5 : Zelle Lebensfähigkeit Assay. Repräsentative Bilder wurden unter dem Mikroskop bei 400 X Vergrößerung. Der Assay verwendet Calcein AM lebenden Zellen visualisieren in grün gebeizt und EthD-1 zu die Kernen der abgestorbenen Zellen visualisieren in Rot gebeizt. (A): ein Follikel mit ~ 100 % live Granulosa Zellen (grün). (B): ein Follikel mit live Granulosa Zellen (grün) sowie mehr als 10 % tote Zellen (rot). Maßstabsleiste = 50 µm.Diese Zahl wurde von Zhang Et Al. modifiziert 17 Klicken Sie bitte hier, um eine größere Version dieser Figur. Abbildung 6 : Immunohistochemistry GDF-9. GDF-9 Protein-Expression wurde untersucht, in die Eizellen im Eierstock Gewebe kultivierten unter 1g oder s-µg Bedingungen für 0, 2 und 4 Tage. Maßstabsleiste = 50 µm. Diese Zahl wurde von Zhang Et Al. modifiziert 17 Klicken Sie bitte hier, um eine größere Version dieser Figur. Abbildung 7 : Ultrastrukturforschung Analyse der isolierten preantral Follikel kultiviert unter 1 – g oder s-µ g Bedingungen am 4. Tag der Kultur. (A) eine Eizelle mit Mikrovilli (Pfeile) erstreckt sich in die Zona Pellucida (1 -g -Bedingung). (B-F) Eizellen mit großen Vakuolen (*), multilamellar Körper (#), Lipid-Tröpfchen (Pfeile), vakuolisierten Mitochondrien Cristae (Pfeil) fehlt, und Dispergieren Golgi-Apparat (Pfeil), bzw. (s-µg Zustand). O: Eizelle; ZP: Zona Pellucida. Diese Zahl wurde von Zhang Et Al. modifiziert 17 Klicken Sie bitte hier, um eine größere Version dieser Figur.

Discussion

Die entscheidenden Schritte für die erfolgreiche Kultivierung von preantral Follikel sind: 1) richtig Auswahl der preantral Follikel nach den Auswahlkriterien, die beschrieben wurden im Protokoll Text 2.1); (2) alle Verfahren in einem skeptischen Zustand Vorformen und Aufrechterhaltung einer sterilen Kultur; und 3) der RWV-Kultur-System korrekt einrichten.

Die Wahrung der Konsistenz von experimentellen Beobachtungen in den Replicate Experimenten ist, identische oder ähnliche Materialien verwenden. Die Kriterien für die Auswahl der Maus preantral Follikel ergab, dass die Follikel 1 hatte) gesunde Eizellen bei der Germinal Vesicle Aufschlüsselung (GVBD) umgeben von einer dünnen Zona Pellucida; (2) 2-3 Schichten Granulosa Zellen von einer Basalmembran umgeben; und 3) einige thecal Zellen an der Basalmembran befestigt. Damit die Follikel ausgewählt hatte nicht nur alle drei funktionellen Fächern von einem Follikel zur Unterstützung der Eizelle Wachstum, sondern auch eine ähnliche morphologische Identifikation mit einem Durchmesser von 90-100 µm.

Dies ist der erste Versuch, Maus preantral Follikel in der Art von 3D Kultivierung in simulierter Schwerelosigkeit wachsen. Mehrere Systeme wurden für die Maus preantral Follikel entwickelt. Eizellen entnommen Follikel kultiviert auf einer ebenen Fläche von Petrischalen, die sogenannte 2D Kultur konnten befruchtet werden und produziert live nachkommen. Darüber hinaus pflegen 3D Kulturen, z. B. Kulturen der Follikel in Alginat Perlen, eine Gewebestruktur ähnlich, was der Körper in hohen Prozentsatz meiotically zuständigen Eizellen produziert. Der Entwicklungsprozess der ovariellen Follikel/Eizellen in einem Null-Schwerkraft-Feld ist jedoch unbekannt. RWV, ein Gerät, das beträchtliche in Tissue Engineering Aufmerksamkeit kann ein simulierter Schwerelosigkeit zu erzeugen und bieten ein ideales Umfeld für die Untersuchung der Auswirkungen der simulierten Schwerelosigkeit auf das Wachstum der ovariellen Follikel/Eizellen in Vitro.

Es ist wichtig, der RWV-Apparat richtig für Zellkultur einzurichten. Die Luftblasen im Behälter müssen entfernt werden. Die Methode zum Entfernen von Luftblasen, wenn in dem Gefäß generiert lautet wie folgt: Legen Sie zwei Spritzen mit 0,5 mL Öl in jedem der zwei Spritze Ports. Öffnen Sie die Ventile steuern die Spritze-Ports. Luftblasen unter der Spritze Hafen zu manövrieren. Ziehen Sie die Luftblasen in der Spritze während der Injektion ungefähr der gleichen Menge an Medien durch die andere Spritze Port. Nachdem alle Luftblasen entfernt werden, schließen Sie die Ventile, entfernen Sie die Spritzen zu und ersetzen Sie die Spritze Port Kappen. Es ist auch entscheidend für die richtige Drehzahl herauszufinden, die verhindert, dass Zellen über eine konstante Rotation absetzen. Optimierung der Drehzahl wird durch das spezifische Gewicht der Zellen, die Flüssigkeitsdichte und die Viskosität bestimmt.

Die Expressionsprofile von PCNA und GDF-9, die ähnlich denen in GDF-9-defizienten Maus Follikel16waren, offenbart, dass simulierte Schwerelosigkeit nachteilige Auswirkungen auf die Entwicklung von Granulosa Zellen und Eizellen hatte. Das Schiff des RWV Geräts drehte sich um eine horizontale Achse in eine 5 % CO2 Brutmaschine, zulassend Permeation von Sauerstoff und Kohlendioxid durch eine Membran in den Rücken, bietet effiziente Oxygenierung und sehr niedrigen Schubspannung, die unwahrscheinlich, zu sein war die Follikel/Eizelle Verletzungen verursachen. Optimierung der Versuchsaufbau und weitere Analysen sind notwendig, um den Mechanismus der die schädlichen Auswirkungen zu untersuchen.

Weitere Studien sind notwendig, um das Entwicklungspotenzial der Eizellen in-vitro- abgeleitet aus der RWV-Kultur-System zu untersuchen. In Vitro Reifung der Eizellen zu MII Bühne wird derzeit durchgeführt. Die endgültige Validierung dieses Kultur-Systems wird durch die Befruchtung Kapazität der abgerufenen Eizellen untersucht werden.

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Die Autoren möchten Yilong Wang und Yanlin Zhao für ihre Unterstützung bei der Pflege der Tiere, Chan Zhang für ihre Unterstützung bei der Vorbereitung der histologischen Proben und Dr. Songtao He für kritisch lesen dieses Manuskript danken. Diese Arbeit wurde unterstützt von Natural Science Foundation of Zhejiang Province (gewähren Nummer: LY13C120002).

Materials

ICR mice SLRC Laoratory 14-day-old female mice
L-15 medium Sigma L1518 With L-glutamine, liquid, sterile-filtered, suitable for cell culture
fetal bovine serum Gibco 10100147 Origin: Australia
Penicillin V potassium Sigma 1504503 United States Pharmacopeia (USP) Reference Standard (USP)
Streptomycin sesquisulfate hydrate Sigma 46754 Analytical standard
Universal Click Pen Needles Penfine 12×1/2" 0.33×12 mm
Alginate Sigma W201502
alpha-minimal essential medium Sigma M0894 Alpha Modification, with L-glutamine, without ribonucleosides, deoxyribonucleosides and sodium bicarbonate, powder, suitable for cell culture
Insulin-selenium-transferrin Invitrogen 51500056 Liquid, sterile-filtered, BioReagent, suitable for cell culture
GONAL-F Merck Serono Recombinant follitropin alfa for injection
Disposable high-aspect-ratio rotating vessel Synthecon 10 mL
Culture oil Vitrolife Sterile light paraffin oil
Alginate Lyase Sigma A1603 powder, >10,000 units/g solid
26 1/2-guage needle Becton Dickinson
35×10mm dish Becton Dickinson
Viability/Cytotoxicity assay Kit Invitrogen L3224
Bouin’s solution Sigma HT10132
Horseradish peroxidase (HRP)-conjugated goat anti-rabbit IgG (H+L) Jackson Immuno-Research Laboratories 111-035-003
3,3N-Diaminobenzidine Tertrahydrochloride Beyotime P0203
Aqueous mounting medium Dako C0563
Rabbit anti-GDF-9 antibody Beijing Biosynthesis Biotechnology BS-175R
Rabbit anti-PCNA antibody Proteintech 24036-1-AP
Methylene blue Sigma M9140
Transmission electron microscope Hitachi H-7500
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References

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Zhang, S., Wu, Y., Weng, Y., Xu, Z., Chen, W., Zheng, D., Lin, W., Liu, J., Zhou, Y. In Vitro Growth of Mouse Preantral Follicles Under Simulated Microgravity. J. Vis. Exp. (130), e55641, doi:10.3791/55641 (2017).
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