В пробирке Рост Preantral фолликулов мыши под искусственной микрогравитации

Этические утверждения для этого исследования была получена из животных исследовательской этики Комитет из Вэнь Чжоу медицинский колледж. 1. Подготовка культуры средств массовой информации и альгинат Гидрогель Подготовка тканей яичника и фолликул обработки среднего с использованием среднего L-15 с 10% плода бычьим сывороточным, 100 МЕ/мл пенициллина и стрептомицина 100 мкг/мл. Хранить при 4 ° C в течение двух недель. Подготовка тканей яичника и фолликул питательной среды, состоящей из альфа минимальный основных средних [α-MEM] ДОПОЛНЕНО плода бычьим сывороточным 5% [FBS], 1% инсулина Селена трансферрин, 10 mIU/мл rFSH, пенициллин 100 МЕ/мл и 100 мкг/мл стрептомицина. Хранить при 4 ° C в течение двух недель. Подготовить альгината гидрогеля с помощью 0,8% (w/v) раствора альгината натрия в стерильных PBS, затем падение 10 мкл этого решения в решение инкапсуляции (140 мм NaCl /50 мм CaCl2) для создания альгината бусины.Примечание: Размер бисера альгината было около 3 мм в диаметре. 2. мышь фолликула изоляции и инкапсуляции Отбирать 14 день старый ICR самок мышей, шейки матки вывих, удаление яичников асептически используя ножницы, щипцы и положить яичников в 2 мл обработки среднего. Пополам яичников с помощью скальпеля. Половина размера тканей яичника был толщиной около 1 мм для культуры в среде культуры. Вручную изолировать фолликулов от яичников, используя 26 1/2-guage иглы под стереомикроскопом X 2-4 и собирать выбранные фолликулов для культуры в среде культуры.Примечание: Критерии отбора фолликул: 1) фолликулы были круглыми с яйцеклеток в середине и 2-3 слоя клеток гранулезы, окружающих ооцитов, 2) фолликулов нетронутыми базальной мембраны, с некоторых клеток теки прилагается, и размер 3) фолликул был 90-100 мкм в диаметре Создайте альгината бусины в шаге 1.3. Вымойте фолликулов с раствора альгината и затем Пипетка одного фолликула в середину каждого альгината шарик, чтобы убедиться, что каждый шарик содержит один фолликул под стереомикроскопом. После промывки в среде культуры, культуры альгината бусины в 150 мкл питательной среды в 35 × 10 мм культуры блюдо или RWV устройства. 3. яичников ткани или фолликул культуры под искусственной микрогравитации Используйте устройство RWV для создания искусственной микрогравитации. Заполните емкость с легкими парафинового масла (~ 10 мл), место 150 мкл питательной среды в капельки нефти, а затем перевести один кусок ткани яичников или три альгината бусины с инкапсулированным фолликулов в средних капли. Закройте крышку порта судно и исправить судна на базе вращающегося устройства. В элементе управления группы, место бусины альгинат, содержащие фолликулов или тканей яичника в 150 мкл питательной среды в капли, покрытые света парафинового масла в 35 × 10 мм культуры блюд. Инкубируйте культуры блюда и RWV устройства в увлажненные инкубатора при 37 ° C с 5% CO2 в воздухе. Чтобы изменить питательной среды в RWV устройства: налить масло и среднего от судна в 150 × 20 мм культуры блюдо, передачи яичников бисером ткани или альгината культуры блюдо с питательной среды. Восстановление системы культуры судна за шаг 3.1. 4. деинкапсуляции и Извлечение фолликулов После 4 дней культивирования наливайте масло и среднего от судна в 150 × 20 мм культуры блюдо. Подбирать альгината бисер и decapsulate фолликулов из бисера альгинат, инкубации в обработке среднего дополнена 10 ед/мл альгината лиазы 30 мин при температуре 37 ° C. Собирать фолликулов и затем промойте их в обработке среднего под стереомикроскопом. 5. яичников ткани и фолликул оценки Assay жизнеспособности клетки Мыть очищенные фолликулов три раза в D-PBS и инкубировать их в 150 мкл комбинированных Assay жизнеспособности клетки реагентов (2 мкм Флуорексон утра и 4 мкм EthD-1) при комнатной температуре 45 мин. Трансфер фолликулов в чистой микроскопа с 10 мкл D-PBS, крышка с coverslip, а затем уплотнение с четкой ноготь польский. Количество зеленых и красных клеток в слайды под микроскопом конфокальный флуоресцирования (400 X).Примечание: В этот assay жизнеспособности, зеленые клетки живых клеток, и красные клетки мертвые клетки. Фолликулы с менее чем 10% эритроцитов (мертвых), рассматриваются как выжили фолликулов. Гематоксилином и эозином (H & E) окрашивания тканей яичника и фолликул Исправьте свежие 14-дневных мыши яичников и preantral фолликулов, изолированные от 14-дневного мышей в Буэна в решении как день 0 образцы. Исправить культурной ткани яичников после либо 2- или 4-день культуры и отдельные фолликулы внутри альгината бусы после 4-день культуры как экспериментальные образцы. Внедрить все образцы в парафин, раздел серийно на 5 микрон толщины и затем пятно с H & E согласно инструкциям производителя. Фолликул подсчета и измерения диаметра В разделах ткани яичников, окрашенных с H & E, граф все фолликулы и здоровой preantral фолликулов в пределах области раздела ткани под микроскопом (увеличение 400 X). Вычислить плотность фолликула путем деления числа preantral фолликулов на общее количество фолликулов.Примечание: здоровый preantral фолликулов являются те, с по крайней мере два слоя клеток гранулезы. Мера фолликула и яйцеклетки диаметра фолликулов день 0 и 4 день культивированный фолликулов. Иммуногистохимии Исправить тканей яичника в параформальдегида 4%, внедрить в парафин, раздел 5-мкм-толщиной и монтирования разделов ткани на слайдах. DEWAX разделы, увлажняет и инкубировать их в буфере цитрат для 15 мин блок эндогенной пероксидазы в 3% перекиси водорода, разоблачать антигена в 5% козьего сыворотки и затем инкубации с первичных антител при комнатной температуре в течение 3 ч. Стирать в PBS на 3 мин, затем инкубировать слайды с разбавленным 1: 500 пероксидазы (ПХ)-конъюгированных коза анти кролик IgG (H + L) за 1 ч при комнатной температуре.Примечание: Первичного антитела, используемые в исследовании были антитела анти GDF-9 кролик (разбавления 1: 500) и антитела анти PCNA кролик (разбавления 1: 200). Инкубируйте слайды яичников секции с 3, 3′-диаминобензидин [DAB] обнаруживать активность пероксидазы и смонтировать на стекле слайды с водной монтажа средних. Наблюдать за яичников разделе Слайды под микроскопом при 400-кратном. Микроскопия электрона передачи [ТЕА] Исправить фолликулов в низкотемпературном растворе глютаральдегида 2,5% за 3 ч при комнатной температуре, затем после исправления в 1% осмия тетраоксид за 1 ч при 37 ° C.Вымойте с PBS, а затем лечить фолликулов с фосфорвольфрамовой кислоты 1% и 1% ацетат натрия уранила за 1 ч при 37 ° C. Обезвоживает фолликулов с помощью ацетона серии: 25, 50, 75, 95 и 100% (3 раза) и эпоксидной смолы ацетон смеси после окончательного 100% ацетона шаг при 37 ° C, а затем вставлять в эпоксидной смолы на 45 ° C. Нарезать внедренные блоки 1,0 мкм полутонкая секции и пятно секции с метиленовым синим 1% для 1-2 мин локализовать фолликулов в блоки. Разрезать встроенных блоков на 50 Нм ультратонких секций и смонтировать разделы на сетках для ТЕА. 6. Статистический анализ Представить все данные в формате среднее ± SEM. Определите, что различия между группами, односторонний дисперсионный анализ (ANOVA) следуют Тьюки множественные сравнения теста. Α порог значение результата теста был установлен на p < 0,05.