Análisis de inducida por ácido retinoico Neural diferenciación de células madre embrionarias de ratón en cuerpos embrioides dos y tres dimensiones

CES se originan a partir de la masa celular interna del blastocisto. Estas células son pluripotentes, es decir, tienen la capacidad de diferenciarse en cualquier tipo de célula del organismo de origen. CES diferenciación in vitro es de gran interés como un sistema experimental para la investigación de las vías y mecanismos de desarrollo. Ofrece un modelo de sistema potente y flexible para probar nuevos enfoques terapéuticos para la corrección de la disfunción de las células y los tejidos. EB recapitulan muchos aspectos de la diferenciación celular durante la embriogénesis temprana. En particular, EBs se pueden utilizar cuando la letalidad embrionaria hace que sea difícil determinar la base celular de los defectos embrionarios ^{1, 2.} EBs pueden formarse ya sea por la gota colgante o técnicas de suspensión líquido ^3. La ventaja de la primera es la capacidad de generar EBs de tamaño uniforme y la densidad, facilitando así la reproducibilidad experimental.

<p class = "jove_content"> Interacción con proteínas de adhesión de la matriz extracelular (ECM) puede afectar la motilidad y supervivencia de las células adherentes. En el sistema de cultivo 2D, la fibronectina se aplica a menudo para aumentar la adhesión de células al sustrato. La fibronectina es un componente de lámina basal reconocido por 10 tipos de superficie celular de integrina heterodímeros ^4.

RA es un pequeño metabolito lipófilo de vitamina A que induce la diferenciación neural ^{5, 6.} Las altas concentraciones de RA promueven la expresión génica neural y reprime la expresión de genes mesodérmico durante la formación de EB ^{7, 8.} RA es producida por la vitamina A oxidación para retinaldehido por alcohol o retinol deshidrogenasa, seguido de oxidación retinaldehido al producto final por retinaldehido deshidrogenasa ^9. diferenciación neural requiere transporte de RA desde el citoplasma al núcleo por celular proteína de unión a RA-2 (CRABP2). En el núcleo, RA se une a su complejo receptor cognado que consiste en un heterodímero RAR-RXR ^10. Esto da como resultado el reclutamiento de co-transcripcional activadores, y la iniciación de la transcripción ^{9, 11.} Además, RA promueve la degradación de fosforilados (activo) Smad1, antagonizando así BMP y SMAD de señalización ^12. Además de estas actividades, RA aumenta la expresión de Pax6, un factor de transcripción que apoya la diferenciación neural ^13. Señalización RA es modulada por sirtuin-1 (Sirt1), un dinucleótido de nicotinamida y adenina nuclear (NAD +) – enzima dependiente que deacetylates CRABP2, interfiriendo con su translocación al núcleo, y por lo tanto con RA de unión al heterodímero RAR-RXR ^{14, 15, 16.}

e_content "> Nuestro objetivo en el diseño del protocolo de EB tratado con RA se describe aquí es optimizar la diferenciación neuronal con el fin de facilitar el análisis in vitro de las vías de señalización que regulan la diferenciación ESC en células precursoras neuronales. Una de las ventajas de este protocolo es la facilitación de el análisis de la función celular por inmunofluorescencia. EBs 3D no están bien penetrada por anticuerpos y son difíciles de imagen. EB disociación en una monocapa 2D en puntos de tiempo específicos durante la diferenciación neural facilita immunolabeling y de formación de imágenes de las células por microscopía confocal.