Summary

L'analyse des rétinoïque induite par l'acide Neuro-Différenciation de cellules souches embryonnaires de souris en deux et trois dimensions corps embryoïdes

Published: April 22, 2017
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Summary

Nous décrivons une technique pour l'utilisation de cellules souches embryonnaires de souris pour générer deux ou trois dimensions des corps embryoïdes. Nous expliquons alors comment induire la différenciation neuronale des cellules du corps embryoïdes par l'acide rétinoïque, et comment analyser leur état de différenciation par immunofluorescence marqueur de cellules progénitrices et immunoblotting.

Abstract

Souris des cellules souches embryonnaires (CSE) isolées de la masse interne du blastocyste (typiquement à E3.5 jour), peut être utilisé comme système modèle in vitro pour étudier le développement embryonnaire précoce. En l'absence de facteur inhibiteur de leucémie (LIF), CES différencient par défaut dans les cellules précurseurs neurales. Ils peuvent être amassés dans un agrégat sphérique en trois dimensions (3D) appelé corps embryoïdes (EB) en raison de sa similitude avec l'embryon à un stade précoce. EB peuvent être ensemencées sur des lamelles revêtues de fibronectine, où ils se détendent en cultivant deux extensions dimensions (2D), ou implantés dans des matrices de collagène 3D où ils continuent de plus en plus sous forme de sphéroïdes, et se différencient en trois couches germinales: endodermique, mésodermique et ectodermique. La culture de collagène 3D imite l'environnement in vivo plus près que la 2D SRU. La culture 2D EB facilite l'analyse par immunofluorescence et immunoblot pour suivre la différenciation. Nous avons développé une differentia neuronale en deux étapesProtocole de tion. Dans la première étape, EBS sont générées par la technique de la goutte suspendue, et, simultanément, sont induites à se différencier par l'exposition à l'acide rétinoïque (RA). Dans la seconde étape, le produit de différenciation de neurones dans un format 2D ou 3D, en l'absence de RA.

Introduction

Proviennent de la CES masse cellulaire interne blastocyste. Ces cellules sont pluripotentes, à savoir qu'ils ont la capacité de se différencier en n'importe quel type de cellule de l'organisme d'origine. ESC différenciation in vitro est d' un grand intérêt en tant que système expérimental pour étudier les voies de développement et les mécanismes. Il offre un système de modèle puissant et flexible pour tester de nouvelles approches thérapeutiques pour la correction du dysfonctionnement des cellules et des tissus. Récapitulent de nombreux aspects EBs de la différenciation cellulaire au cours de l'embryogenèse précoce. En particulier EbS peuvent être utilisés lorsque l' embryon rend la létalité difficile de déterminer la base cellulaire des défauts embryonnaires 1, 2. EB peuvent être formés soit par des techniques de suspension goutte suspendue ou liquides 3. L'avantage de la première est la capacité de générer des EBs de taille uniforme et de densité, facilitant ainsi la reproductibilité expérimentale.

<p class = « jove_content »> L'interaction avec les protéines d'adhésion matrice extracellulaire (ECM) peut affecter la motilité et la survie des cellules adhérentes. Dans le système de culture 2D, la fibronectine est souvent appliquée pour augmenter l'adhérence des cellules au substrat. La fibronectine est un composant de membrane basale reconnu par 10 types de surface cellulaire hétérodimères d' intégrines 4.

RA est un petit métabolite lipophile de la vitamine A qui induit la différenciation des neurones 5, 6. De fortes concentrations de RA favorisent l' expression du gène de neurones et réprime l' expression du gène mésodermique pendant la formation EB 7, 8. RA est produite par oxydation de la vitamine A rétinaldéhyde soit par l'alcool déshydrogénase ou rétinol, suivie d' une oxydation de rétinaldéhyde pour le produit final par le rétinaldéhyde déshydrogénase 9. différenciation neurale nécessite le transport de la PR du cytoplasme au noyau par la protéine de liaison cellulaire RA-2 (CRABP2). Dans le noyau, RA se lie à son récepteur apparenté complexe consistant en un hétérodimère RAR-RXR 10. Cela se traduit par le recrutement de co-activateurs de transcription et l'initiation de la transcription 9, 11. En outre, RA favorise la dégradation de phosphorylé (active) SMAD1, ainsi antagoniser la signalisation BMP et SMAD 12. En plus de ces activités, RA augmente l' expression de Pax6, un facteur de transcription qui favorise la différenciation des neurones 13. La signalisation de la PR est modulée par sirtuines-1 (Sirt1), une nicotinamide adénine dinucléotide nucléaire (NAD +) – enzyme dépendante qui désacétyle CRABP2, en interférant avec sa translocation vers le noyau, et donc avec RA liaison à l'hétérodimère RAR-RXR 14, 15, 16.

e_content "> Notre objectif dans la conception du protocole EB-traité RA décrit ici est d'optimiser la différenciation neuronale afin de faciliter l' analyse in vitro des voies de signalisation qui régulent la différenciation ESC dans les cellules précurseurs neuronaux. L' un des avantages de ce protocole est la facilitation de l'analyse de la fonction des cellules par immunofluorescence. 3D EB ne sont pas bien pénétré par les anticorps et sont difficiles à image. dissociation EB dans une monocouche 2D à des moments spécifiques au cours de la différenciation neuronale facilite l'immunomarquage et l'imagerie des cellules par microscopie confocale.

Protocol

1. La culture de fibroblastes embryonnaires de souris (FAE) Préparer le milieu MEF, le milieu de Eagle modifié par Dulbecco (DMEM, à haute glucose), supplémenté avec 15% de sérum de fœtus bovin (FBS). Manteau de 100 mm des boîtes de culture cellulaire avec une solution de gélatine à 0,5% pendant 30 min à température ambiante (RT). Count en utilisant un cytomètre FAE. Retirer la solution de gélatine et verser immédiatement milieu MEF pré-chauffé à 37 ° C. Décongeler rapi…

Representative Results

Oct4, Nanog, et SOX2 sont les facteurs de transcription de base qui confèrent ESC auto-renouvellement et la pluripotence. Nous avons appliqué le protocole ci – dessus pour comparer la différenciation neuronale des CES de type sauvage et d'une souche de souris génétiquement modifiées où Syx, un gène codant pour le facteur d'échange spécifique de RhoA Syx, est perturbé. Nous avions impliqués dans l' angiogenèse Syx 18. Nous avons re…

Discussion

Dans ce protocole, nous présentons une méthode relativement simple et accessible pour étudier la différenciation neuronale des souris CES. Dans les protocoles précédents, RA a été ajouté au milieu au jour 2 ou 4 jours de la tenture-drop EB 8 ou par culture en suspension 7, respectivement, ou immédiatement après l'agrégation goutte suspendue EB 21. Dans le protocole que nous avons conçu, RA a été ajouté plus tôt. En dépit de la …

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Cette étude a été soutenue par subvention du NIH R01 HL119984 AH

Materials

Materials
MEFs EMD Millipore PMEF-CF ESC feeder layer
ESC EMD Millipore CMTI-2
Cell culture dish (60 mm) Eppendorf 30701119 Cell culture
Cell culture dish (100 mm) Falcon 353003 Cell culture
Petri dish (100 mm) Corning 351029 Hanging drops
24-well plate Greiner Bio-One 662160 2D EBs
6-well plate Eppendorf 30720113 Transfection
Dark 1.5 ml centrifuge tube Celltreat Scientific Products 229437 RA stock solution
Microscope cover-glass Fisherbrand 12-545-80 Circular, 12 mm diameter
Superfrost-plus microscope slides Fisherbrand 12-550-15
3D collagen culture kit EMD Millipore ECM675 3D culture
Effectene Transfection Reagent Qiagen 301427 Stem cell transfection
Microcon Centrifugal Filters (10 kDa) EMD Millipore MRCPRT010 Protein concentration
Name  Company Catalog Number Comments
Reagents
DMEM Lonza 12-709F MEFs culture
IMDM Gibco 12440-046 ESCs culture
Fetal bovine serum (FBS) EMD Millipore ES-009-B ESCs culture
Gelatin Sigma-Aldrich G2625 Dish coating
LIF R&D Systems 8878-LF-025 To maintain ESC pluripotency
MEM Non-Essential Amino Acids Solutions Gibco 11140050 Cell culture
2-Mercaptoethanol Gibco 21985023 Cell culture
Penicillin-Streptomycin Gibco 15140122 Cell culture
Gentamicin Gibco 15750060 Cell culture
MycoZap Plus-PR Lonza VZA-2022 Cell culture
0.25% Trypsin-EDTA Gibco 25200-072 Cell culture
DMSO Sigma-Aldrich D2650
All-trans-retinoic acid Sigma-Aldrich R2625-50MG Induction of neural differentiation
Bovine Serum Albumin Sigma-Aldrich A7030-50G Blocking and antibody dilution 
Triton X-100 Sigma-Aldrich T8787-100ML Cell membrane permeabilization
Cell strainer Corning 352360
Prolong Gold anti-fade reagent with DAPI Life Tech. P36931 Mounting reagent
16% Paraformaldehyde  Electron Microscopy Sciences 15710 Cell fixation
Fibronectin R&D Systems 1030-FN Dish coating
PBS Gibco 10010049
Collagenase type I Worthington Biochem. Corp LS004196 EB dissociation
Name  Company Catalog Number Comments
Primary Antibodies
Nestin (Rat-401) Santa Cruz Biotech sc-33677 Detection of neural differentiation
Oct4 Santa Cruz Biotech sc-5279 Detection of neural differentiation
Nanog Bethyl Laboratories A300-398A Detection of neural differentiation
Sox2 Cell Signaling 3579 Detection of neural differentiation
Tubulin b3 (AA10) Santa Cruz Biotech sc-80016 Detection of neural differentiation
Name  Company Catalog Number Comments
Secondary Antibodies
Donkey anti-Mouse-Alexa555 Life Tech. A31570 Immunofluorescence
Donkey anti-mouse-Alexa488  Life Tech. A21202 Immunofluorescence
Name  Company Catalog Number Comments
Instruments
Wide-field microscope Nikon Eclipse TS100 Cell culture imaging
Confocal microscope Nikon C2 Immunofluorescence imaging

References

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Cite This Article
Yang, J., Wu, C., Stefanescu, I., Horowitz, A. Analysis of Retinoic Acid-induced Neural Differentiation of Mouse Embryonic Stem Cells in Two and Three-dimensional Embryoid Bodies. J. Vis. Exp. (122), e55621, doi:10.3791/55621 (2017).

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