Summary

Analisi di acido retinoico-indotta neurale differenziazione di cellule staminali embrionali di topo a organi embrionali due e tridimensionali

Published: April 22, 2017
doi:

Summary

Descriviamo una tecnica per utilizzare le cellule staminali embrionali murine per generare due o tre corpi embrionali tridimensionali. Abbiamo poi spiegato come indurre la differenziazione neuronale delle cellule del corpo embrionali di acido retinoico, e come analizzare il loro stato di differenziazione dal marcatore di cellule progenitrici immunofluorescenza e immunoblotting.

Abstract

Le cellule staminali embrionali di topo (CES) isolati dalla massa interna della blastocisti (tipicamente a giorno E3.5), può essere utilizzato come sistema modello in vitro per lo studio sviluppo embrionale precoce. In assenza di fattore inibitorio della leucemia (LIF), CES differenziano per default in cellule precursori neurali. Essi possono essere ammassati in una tridimensionale (3D) aggregato sferico definito corpo embrioide (EB) a causa della sua somiglianza con l'embrione in fase iniziale. EBs possono essere seminati su vetrini fibronectina rivestite, dove si espandono coltivando due estensioni (2D) dimensionali, o impiantati in matrici di collagene 3D dove continuano a crescere come sferoidi, e si differenziano in tre strati germinali: endodermica, mesoderma e ectodermica. La cultura collagene 3D simula l'ambiente in vivo più da vicino di EBS 2D. La cultura 2D EB facilita l'analisi per immunofluorescenza e immunoblotting per monitorare differenziazione. Abbiamo sviluppato una differenziazione neuronale in due fasiprotocollo zione. Nella prima fase, EBs sono generati dalla sospensione tecnica-drop, e, contemporaneamente, vengono indotte a differenziarsi da esposizione all'acido retinoico (RA). Nella seconda fase, neurali procede differenziazione in formato 2D o 3D in assenza di RA.

Introduction

CES provengono dalla massa cellulare interna della blastocisti. Queste cellule sono pluripotenti, cioè hanno la capacità di differenziarsi in qualsiasi tipo di cellula dell'organismo di origine. ESC differenziazione in vitro è di grande interesse, come un sistema sperimentale per studiare percorsi e meccanismi di sviluppo. Offre un potente e flessibile sistema modello per la sperimentazione di nuovi approcci terapeutici per la correzione della disfunzione delle cellule e dei tessuti. EBs ricapitolano molti aspetti della differenziazione cellulare durante l'embriogenesi precoce. In particolare, EBs possono essere utilizzati quando letalità embrionale rende difficile determinare la base cellulare dei difetti embrionali 1, 2. EBs possono essere formate mediante la goccia sospesa o tecniche sospensione liquida 3. Il vantaggio del primo è la capacità di generare EBS di dimensioni e densità costante, facilitando così la riproducibilità sperimentale.

<p class = "jove_content"> interazione con proteine ​​di adesione extracellulari della matrice (ECM) può influenzare la motilità e la sopravvivenza delle cellule aderenti. Nel sistema di coltura 2D, fibronectina è spesso applicato per aumentare l'adesione delle cellule al substrato. Fibronectina è un componente lamina basale riconosciuto da 10 tipi di superficie cellulare integrine eterodimeri 4.

RA è una piccola metabolita della vitamina A lipofilo che induce neurale differenziazione 5, 6. Elevate concentrazioni di RA promuovere genica neurale e reprime l'espressione genica mesoderma durante la formazione EB 7, 8. RA è prodotto da vitamina A ossidazione retinaldehyde da uno o alcol deidrogenasi retinolo, seguita da ossidazione retinaldehyde al prodotto finale retinaldehyde deidrogenasi 9. differenziazione neurale richiede il trasporto di RA dal citoplasma al nucleo da cellule RA-binding protein 2 (CRABP2). Nel nucleo, RA si lega al suo recettore affine costituito da un eterodimero RAR-RXR 10. Ciò si traduce nel reclutamento di co-attivatori trascrizionali, e l'inizio della trascrizione 9, 11. Inoltre, RA promuove la degradazione di fosforilato (attivo) SMAD1, contrapponendosi così BMP e SMAD segnalazione 12. Oltre a queste attività, RA aumenta l'espressione di Pax6, un fattore di trascrizione che supporta neurale differenziazione 13. Segnalazione RA è modulata da sirtuin-1 (Sirt1), un dinucleotide adenina nicotinammide nucleare (NAD +) – enzima dipendente che deacetylates CRABP2, interferendo con la sua traslocazione al nucleo, e quindi con RA legame al eterodimero RAR-RXR 14, 15, 16.

e_content "> Il nostro obiettivo nella progettazione del protocollo EB RA-trattati qui descritto è quello di ottimizzare la differenziazione neuronale al fine di facilitare l'analisi in vitro delle vie di segnalazione che regolano la differenziazione ESC in cellule precursori neuronali. Uno dei vantaggi di questo protocollo è facilitazione l'analisi della funzione delle cellule mediante immunofluorescenza. 3D EBs non sono ben penetrato da anticorpi e sono difficilmente immagine. EB dissociazione in un monostrato 2D in punti temporali specifici durante la differenziazione neuronale facilita immunomarcatura e l'imaging delle cellule mediante microscopia confocale.

Protocol

1. Cultura di fibroblasti embrionali di topo (MEF) Preparare mezzo MEF, mezzo di Dulbecco modificato da Eagle (DMEM, high-glucosio), supplementato con siero fetale bovino 15% (FBS). Cappotto 100 mm piatti di coltura di cellule con soluzione di gelatina allo 0,5% per 30 min a temperatura ambiente (RT). Conte MEF usando un citometro. Rimuovere la soluzione di gelatina e versare immediatamente medio MEF pre-riscaldato a 37 ° C. Scongelare rapidamente fiale di mitomicina C MEF trattata in un …

Representative Results

Oct4, Nanog, e SOX2 sono i fattori di trascrizione fondamentali che conferiscono ESC auto-rinnovamento e pluripotenza. Abbiamo applicato il protocollo di cui sopra per confrontare la differenziazione neuronale dei CES da wild type e da un ceppo di topi geneticamente modificati in cui Syx, un gene che codifica per il fattore di scambio RhoA-specifica Syx, è interrotta. Avevamo implicati Syx nell'angiogenesi 18. Abbiamo notato differenze nei comportame…

Discussion

In questo protocollo vi presentiamo un metodo relativamente semplice e accessibile per studiare la differenziazione neuronale dei CES murini. In precedenti protocolli, RA è stato aggiunto al mezzo al giorno 2 o 4 giorni della EB hanging-goccia 8 o coltura in sospensione 7, rispettivamente, o immediatamente dopo l'EB appeso aggregazione goccia 21. Nel protocollo abbiamo ideato, RA è stato aggiunto in precedenza. Nonostante l'introduzione an…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Questo studio è stato sostenuto da NIH concedere R01 HL119984 AH

Materials

Materials
MEFs EMD Millipore PMEF-CF ESC feeder layer
ESC EMD Millipore CMTI-2
Cell culture dish (60 mm) Eppendorf 30701119 Cell culture
Cell culture dish (100 mm) Falcon 353003 Cell culture
Petri dish (100 mm) Corning 351029 Hanging drops
24-well plate Greiner Bio-One 662160 2D EBs
6-well plate Eppendorf 30720113 Transfection
Dark 1.5 ml centrifuge tube Celltreat Scientific Products 229437 RA stock solution
Microscope cover-glass Fisherbrand 12-545-80 Circular, 12 mm diameter
Superfrost-plus microscope slides Fisherbrand 12-550-15
3D collagen culture kit EMD Millipore ECM675 3D culture
Effectene Transfection Reagent Qiagen 301427 Stem cell transfection
Microcon Centrifugal Filters (10 kDa) EMD Millipore MRCPRT010 Protein concentration
Name  Company Catalog Number Comments
Reagents
DMEM Lonza 12-709F MEFs culture
IMDM Gibco 12440-046 ESCs culture
Fetal bovine serum (FBS) EMD Millipore ES-009-B ESCs culture
Gelatin Sigma-Aldrich G2625 Dish coating
LIF R&D Systems 8878-LF-025 To maintain ESC pluripotency
MEM Non-Essential Amino Acids Solutions Gibco 11140050 Cell culture
2-Mercaptoethanol Gibco 21985023 Cell culture
Penicillin-Streptomycin Gibco 15140122 Cell culture
Gentamicin Gibco 15750060 Cell culture
MycoZap Plus-PR Lonza VZA-2022 Cell culture
0.25% Trypsin-EDTA Gibco 25200-072 Cell culture
DMSO Sigma-Aldrich D2650
All-trans-retinoic acid Sigma-Aldrich R2625-50MG Induction of neural differentiation
Bovine Serum Albumin Sigma-Aldrich A7030-50G Blocking and antibody dilution 
Triton X-100 Sigma-Aldrich T8787-100ML Cell membrane permeabilization
Cell strainer Corning 352360
Prolong Gold anti-fade reagent with DAPI Life Tech. P36931 Mounting reagent
16% Paraformaldehyde  Electron Microscopy Sciences 15710 Cell fixation
Fibronectin R&D Systems 1030-FN Dish coating
PBS Gibco 10010049
Collagenase type I Worthington Biochem. Corp LS004196 EB dissociation
Name  Company Catalog Number Comments
Primary Antibodies
Nestin (Rat-401) Santa Cruz Biotech sc-33677 Detection of neural differentiation
Oct4 Santa Cruz Biotech sc-5279 Detection of neural differentiation
Nanog Bethyl Laboratories A300-398A Detection of neural differentiation
Sox2 Cell Signaling 3579 Detection of neural differentiation
Tubulin b3 (AA10) Santa Cruz Biotech sc-80016 Detection of neural differentiation
Name  Company Catalog Number Comments
Secondary Antibodies
Donkey anti-Mouse-Alexa555 Life Tech. A31570 Immunofluorescence
Donkey anti-mouse-Alexa488  Life Tech. A21202 Immunofluorescence
Name  Company Catalog Number Comments
Instruments
Wide-field microscope Nikon Eclipse TS100 Cell culture imaging
Confocal microscope Nikon C2 Immunofluorescence imaging

References

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Cite This Article
Yang, J., Wu, C., Stefanescu, I., Horowitz, A. Analysis of Retinoic Acid-induced Neural Differentiation of Mouse Embryonic Stem Cells in Two and Three-dimensional Embryoid Bodies. J. Vis. Exp. (122), e55621, doi:10.3791/55621 (2017).

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