Анализ ретиноевой кислоты-индуцированной Neural дифференциации эмбриональных стволовых клеток мыши в двух и трех-мерных эмбриональных телец

ЭСК происходит из бластоцисты внутренней клеточной массы. Эти клетки плюрипотентные, то есть они обладают способностью дифференцироваться в любой тип клеток организма происхождения. ESC дифференцировки в пробирке имеет широкий интерес в качестве экспериментальной системы для исследования путей и механизмов развития. Он предлагает мощную и гибкую систему модели для тестирования новых терапевтических подходов для коррекции клеточной и тканевой дисфункции. ЭТ резюмировать многие аспекты дифференцировки клеток на ранних стадиях эмбриогенеза. В частности, ЭТ может быть использован , когда эмбриональная летальность делает его трудно определить клеточную основу эмбриональных дефектов ^{1, 2.} ЭТ может быть образован либо за счет висячей капли или жидких методов подвески ^3. Преимущество первого является способность генерировать ЭТ последовательного размера и плотности, что облегчает экспериментальную воспроизводимость.

<p cдеваха = «jove_content»> Взаимодействие с внеклеточным матриксом (ECM) белков адгезии может повлиять на подвижность и выживание адгезивных клеток. В системе культуры 2D, фибронектин часто применяются для увеличения адгезии клеток с субстратом. Фибронектина является базальной пластинкой компонент распознается 10 типов клеточной поверхности интегрин гетеродимеров ^4.

РА представляет собой небольшой липофильный метаболит витамина А , который индуцирует дифференцировку нейронную ^{5, 6.} Высокие концентрации RA способствуют экспрессии генов и нейронную репрессирует экспрессию гена мезодермального в процессе формирования EB ^{7, 8.} РА получают путем окисления витамина А , чтобы ретинальдегида либо спиртом или ретинола дегидрогеназы, с последующим окислением ретинальдегида до конечного продукта с помощью ретинальдегида дегидрогеназы ^9. Нейронная дифференциация требует транспорта РА из цитоплазмы к ядру с помощью клеточного белка РА-2 (связывание CRABP2). В ядре РА связывается с родственным рецепторным комплексом , состоящим из гетеродимер RAR-RXR ^10. Это приводит к тому набору транскрипционных ко-активаторы и инициации транскрипции ^{9, 11.} Кроме того, РА способствует деградации фосфорилированного (активной) Smad1, таким образом антагонизма BMP и СМАД сигнализации ^12. В дополнение к этим деятельности, РА повышает экспрессию Pax6, фактор транскрипции , который поддерживает нейронную дифференциацию ^13. Сигнализации РА модулируется Sirtuin-1 (Sirt1), ядерным никотинамидадениндинуклеотид (НАД +) – зависимый фермент , который деацетилирует CRABP2, препятствуя его транслокацию в ядро, и , следовательно , с РА связывания с RAR-RXR гетеродимер ^{14, 15, 16.}

e_content "> Наша цель при разработке RA-обработанную протокол EB , описанный здесь , чтобы оптимизировать нейронную дифференциацию для того , чтобы облегчить анализ витро сигнальных путей , которые регулируют ESC дифференцировку в нейрональные клетки – предшественники. Одним из преимуществ этого протокола является содействие анализ функции клеток с помощью иммунофлюоресценции. 3D ЭТ не хорошо проникает антитела и их трудно изображение. EB диссоциации в 2D монослой в определенные моменты времени в ходе дифференцировка нервная облегчает иммунноокрашивание и визуализацию клеток с помощью конфокальной микроскопии.