Summary

ניתוח של החומצה הרטינואית המושרה בידול עצבית של תאי גזע עובריים עכבר בשניים ובשלושה-ממדי גופים Embryoid

Published: April 22, 2017
doi:

Summary

אנו מתארים שיטה לשימוש בתאי גזע עובריים בעכברים ליצירה שניים או שלושה גופי embryoid ממדים. לאחר מכן נסביר כיצד להשרות התמיינות עצבית של תאי הגוף Embryoid ידי חומצה רטינואית, וכיצד לנתח מצב הבידול שלהם על ידי immunofluorescence סמן תא אב ו immunoblotting.

Abstract

תאי גזע עובריים עכבר (ESCs) מבודדים מן המסה הפנימית של הבלסטוציסט (בדרך כלל ב E3.5 יום), יכול לשמש כמערכת מודל במבחנה לחקר ההתפתחות העוברית המוקדמת. בהעדר גורם מעכבות לוקמיה (LIF), ESCs להבדיל כברירת מחדל לתוך תאים עצביים מבשר. הם יכולים להיות צברו לתוך תלת ממדים (3D) המצרפי כדורי כינת גוף embryoid (EB) בשל הדמיון שלה לעובר בשלב מוקדם. EBS ניתן זורעים על coverslips פיברונקטין מצופה, ושם מתפשטים ידי הגוברת שני ממדי (2D) הרחבות, או מושתל מטריצות קולגן 3D שבו הם להמשיך ולצמוח כפי spheroids, להתמיין שכבות נבט שלושה: endodermal, mesodermal, ו ectodermal. תרבות קולגן 3D המחקה את הסביבה vivo הדוק יותר מאשר EBS 2D. תרבות 2D EB מקלה על ניתוחים ידי immunofluorescence ו immunoblotting לעקוב בידול. פתחנו differentia שני שלבים עצבייםפרוטוקול tion. בשלב הראשון, EBS נוצרת על ידי טכניקת תליית הטיפה, וגם, בו זמנית, הם המושרה להבדיל ידי חשיפת חומצה רטינואית (RA). בשלב השני, התמיינות עצבית בפורמט 2D או 3D בהעדר RA.

Introduction

ESCs מקורם מסת התאים הפנימית הבלסטוציסט. תאים אלה הם pluripotent, כלומר יש להם את היכולת להתמיין לכל סוג תא של האורגניזם ממוצא. בידול ESC במבחנה הוא עניין רחב כמערכת ניסיונית חוקר מסלולים ומנגנונים התפתחותי. הוא מציע מערכת מודל חזקה וגמישה לבחון גישות טיפוליות חדשות תיקון של תפקוד תאים ורקמות. EBS לשחזר היבטים רבים של התמיינות תאים במהלך העובר מוקדם. בפרט, EBS ניתן להשתמש כאשר הקטלניות עובריים מקשה לקבוע את הבסיס התאי של מומים עובריים 1, 2. EBS יכול להיוצר גם על ידי Drop Hanging או טכניקות השעיה נוזלות 3. היתרון של לשעבר הוא היכולת ליצור EBS של גודל וצפיפות עקביים, ובכך להקל על שחזור ניסיוני.

<p c= נער "jove_content"> אינטראקציה עם תאי מטריקס (ECM) חלבונים דבקים עשויה להשפיע על תנועתיות והישרדות של תאים חסידים. במערכת התרבות 2D, פיברונקטין מוחל לעתים קרובות כדי להגדיל את הידבקות התא למצע. פיברונקטין הוא מרכיב lamina בסיס מוכר על ידי 10 סוגים של פני שטח תא integrin heterodimers 4.

RA הוא מטבוליט lipophilic קטן של ויטמין A אשר גורמת בידול עצבי 5, 6. ריכוזים גבוהים של RA לקדם ביטוי גנים עצבי ואת מדחיקת ביטוי גני mesodermal במהלך היווצרות 7 EB, 8. RA מופק על ידי ויטמין A חמצון כדי retinaldehyde ידי אחד dehydrogenase אלכוהול או רטינול, ואחריו חמצון retinaldehyde למוצר הסופי על ידי retinaldehyde דהידרוגנז 9. בידול עצבי דורש הובלה של RA מן הציטופלסמה אל הגרעין ידי חלבון תאי RA-מחייב 2 (CRABP2). בגרעין, RA נקשר לקולטן מורכב מאותו המקור שלה מורכב heterodimer RAR-RXR 10. התוצאה היא גיוס של ממריצים-שיתוף תעתיק, וגם בהוצאת תעתיק 9, 11. יתר על כן, RA מקדמת את ההשפלה של פוספורילציה (פעיל) SMAD1, ובכך קומם BMP ו הסמאד איתות 12. בנוסף לפעילויות אלה, RA מגביר ביטוי Pax6, גורם שעתוק התומך בידול עצבי 13. איתות RA היא מווסתת על ידי הסירטואינים-1 (SIRT1) חברה dinucleotide אדנין nicotinamide גרעיני (NAD +) – אנזים תלוי כי הוא מסיר קבוצות אצטיל CRABP2, מפריעים טרנסלוקציה שלו אל גרעין, ולכן עם RA מחייב heterodimer RAR-RXR 14, 15, 16.

e_content "> מטרתנו בעיצוב פרוטוקול EB RA שטופל המתואר כאן היא למטב בידול עצבי כדי להקל במבחנת ניתוח של מסלולי איתות המווסתים בידול ESC לתוך תאים מבשרים עצביים. אחד היתרונות של פרוטוקול זה הוא סיוע של הניתוח של תפקוד תא על ידי immunofluorescence. EBS 3D אינו חדר היטב על ידי נוגדנים וקשים תמונה. דיסוציאציה EB לתוך בשכבת 2D בנקודות ספציפיות עת במהלך בידול עצבי מקל immunolabeling הדמיה של התאים על ידי מיקרוסקופ confocal.

Protocol

1. תרבות של פיברובלסטים עכבר עובריים (MEFs) כן בינוני MEF, המדיום של הנשר השונה של Dulbecco (DMEM, גבוהה גלוקוז), בתוספת 15% בסרום שור עובר (FBS). מנות תרבית תאים מעיל 100 מ"מ עם פתרון ג'לטין 0.5% למשך 30 דקות ?…

Representative Results

Oct4, Nanog, ו Sox2 הם גורמי שעתוק הליבה המקנות התחדשות עצמית מגוונת" ESC. יישמנו בפרוטוקול לעיל כדי להשוות את הבידול העצבי של ESCs מן סוג בר מן זן של עכברים גנטיים השונים שבו Syx, גן המקודד את גורם RhoA הספציפי החילופי Syx, מופר. אנחנו סבכנו Syx ב אנגיוגנזה <sup cla…

Discussion

בפרוטוקול זה אנו מציגים שיטה פשוטה ונגישה יחסית ללמוד בידול עצבי של ESCs בעכברים. בשנת הפרוטוקולים קודמים, RA נוספה המדיום ביום 2 או יום 4 של הירידה התלויה-EB 8 או על ידי השעית תרבות 7, בהתאמה, או מייד לאחר EB תלוי צבירת ירידת 21. בפרוטוקו?…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

מחקר זה נתמך על ידי מענק NIH R01 HL119984 כדי AH

Materials

Materials
MEFs EMD Millipore PMEF-CF ESC feeder layer
ESC EMD Millipore CMTI-2
Cell culture dish (60 mm) Eppendorf 30701119 Cell culture
Cell culture dish (100 mm) Falcon 353003 Cell culture
Petri dish (100 mm) Corning 351029 Hanging drops
24-well plate Greiner Bio-One 662160 2D EBs
6-well plate Eppendorf 30720113 Transfection
Dark 1.5 ml centrifuge tube Celltreat Scientific Products 229437 RA stock solution
Microscope cover-glass Fisherbrand 12-545-80 Circular, 12 mm diameter
Superfrost-plus microscope slides Fisherbrand 12-550-15
3D collagen culture kit EMD Millipore ECM675 3D culture
Effectene Transfection Reagent Qiagen 301427 Stem cell transfection
Microcon Centrifugal Filters (10 kDa) EMD Millipore MRCPRT010 Protein concentration
Name  Company Catalog Number Comments
Reagents
DMEM Lonza 12-709F MEFs culture
IMDM Gibco 12440-046 ESCs culture
Fetal bovine serum (FBS) EMD Millipore ES-009-B ESCs culture
Gelatin Sigma-Aldrich G2625 Dish coating
LIF R&D Systems 8878-LF-025 To maintain ESC pluripotency
MEM Non-Essential Amino Acids Solutions Gibco 11140050 Cell culture
2-Mercaptoethanol Gibco 21985023 Cell culture
Penicillin-Streptomycin Gibco 15140122 Cell culture
Gentamicin Gibco 15750060 Cell culture
MycoZap Plus-PR Lonza VZA-2022 Cell culture
0.25% Trypsin-EDTA Gibco 25200-072 Cell culture
DMSO Sigma-Aldrich D2650
All-trans-retinoic acid Sigma-Aldrich R2625-50MG Induction of neural differentiation
Bovine Serum Albumin Sigma-Aldrich A7030-50G Blocking and antibody dilution 
Triton X-100 Sigma-Aldrich T8787-100ML Cell membrane permeabilization
Cell strainer Corning 352360
Prolong Gold anti-fade reagent with DAPI Life Tech. P36931 Mounting reagent
16% Paraformaldehyde  Electron Microscopy Sciences 15710 Cell fixation
Fibronectin R&D Systems 1030-FN Dish coating
PBS Gibco 10010049
Collagenase type I Worthington Biochem. Corp LS004196 EB dissociation
Name  Company Catalog Number Comments
Primary Antibodies
Nestin (Rat-401) Santa Cruz Biotech sc-33677 Detection of neural differentiation
Oct4 Santa Cruz Biotech sc-5279 Detection of neural differentiation
Nanog Bethyl Laboratories A300-398A Detection of neural differentiation
Sox2 Cell Signaling 3579 Detection of neural differentiation
Tubulin b3 (AA10) Santa Cruz Biotech sc-80016 Detection of neural differentiation
Name  Company Catalog Number Comments
Secondary Antibodies
Donkey anti-Mouse-Alexa555 Life Tech. A31570 Immunofluorescence
Donkey anti-mouse-Alexa488  Life Tech. A21202 Immunofluorescence
Name  Company Catalog Number Comments
Instruments
Wide-field microscope Nikon Eclipse TS100 Cell culture imaging
Confocal microscope Nikon C2 Immunofluorescence imaging

References

  1. Hopfl, G., Gassmann, M., Desbaillets, I. Differentiating embryonic stem cells into embryoid bodies. Methods Mol Biol. 254, 79-98 (2004).
  2. Itskovitz-Eldor, J., et al. Differentiation of human embryonic stem cells into embryoid bodies compromising the three embryonic germ layers. Mol Med. 6 (2), 88-95 (2000).
  3. Dang, S. M., Kyba, M., Perlingeiro, R., Daley, G. Q., Zandstra, P. W. Efficiency of embryoid body formation and hematopoietic development from embryonic stem cells in different culture systems. Biotechnol Bioeng. 78 (4), 442-453 (2002).
  4. Johansson, S., Svineng, G., Wennerberg, K., Armulik, A., Lohikangas, L. Fibronectin-integrin interactions. Front Biosci. 2, d126-d146 (1997).
  5. Blumberg, B. An essential role for retinoid signaling in anteroposterior neural specification and neuronal differentiation. Semin Cell Dev Biol. 8 (4), 417-428 (1997).
  6. Ross, S. A., McCaffery, P. J., Drager, U. C., De Luca, L. M. Retinoids in embryonal development. Physiol Rev. 80 (3), 1021-1054 (2000).
  7. Bain, G., Ray, W. J., Yao, M., Gottlieb, D. I. Retinoic acid promotes neural and represses mesodermal gene expression in mouse embryonic stem cells in culture. Biochem Biophys Res Commun. 223 (3), 691-694 (1996).
  8. Okada, Y., Shimazaki, T., Sobue, G., Okano, H. Retinoic-acid-concentration-dependent acquisition of neural cell identity during in vitro differentiation of mouse embryonic stem cells. Dev Biol. 275 (1), 124-142 (2004).
  9. Duester, G. Retinoic acid synthesis and signaling during early organogenesis. Cell. 134 (6), 921-931 (2008).
  10. Niederreither, K., Dolle, P. Retinoic acid in development: towards an integrated view. Nat Rev Genet. 9 (7), 541-553 (2008).
  11. Maden, M. Retinoic acid in the development, regeneration and maintenance of the nervous system. Nat Rev Neurosci. 8 (10), 755-765 (2007).
  12. Sheng, N., et al. Retinoic acid regulates bone morphogenic protein signal duration by promoting the degradation of phosphorylated Smad1. Proc Natl Acad Sci U S A. 107 (44), 18886-18891 (2010).
  13. Gajovic, S., St-Onge, L., Yokota, Y., Gruss, P. Retinoic acid mediates Pax6 expression during in vitro differentiation of embryonic stem cells. Differentiation. 62 (4), 187-192 (1997).
  14. Dong, D., Ruuska, S. E., Levinthal, D. J., Noy, N. Distinct roles for cellular retinoic acid-binding proteins I and II in regulating signaling by retinoic acid. J Biol Chem. 274 (34), 23695-23698 (1999).
  15. Sessler, R. J., Noy, N. A ligand-activated nuclear localization signal in cellular retinoic acid binding protein-II. Mol Cell. 18 (3), 343-353 (2005).
  16. Tang, S., et al. SIRT1-Mediated Deacetylation of CRABPII Regulates Cellular Retinoic Acid Signaling and Modulates Embryonic Stem Cell Differentiation. Mol Cell. 55 (6), 843-855 (2014).
  17. Yang, J., et al. RhoA inhibits neural differentiation in murine stem cells through multiple mechanisms. Sci Signal. 9 (438), ra76 (2016).
  18. Garnaas, M. K., et al. Syx, a RhoA guanine exchange factor, is essential for angiogenesis in Vivo. Circ Res. 103 (7), 710-716 (2008).
  19. Chou, Y. H., Khuon, S., Herrmann, H., Goldman, R. D. Nestin promotes the phosphorylation-dependent disassembly of vimentin intermediate filaments during mitosis. Mol Biol Cell. 14 (4), 1468-1478 (2003).
  20. Arai, T., Matsumoto, G. Subcellular localization of functionally differentiated microtubules in squid neurons: regional distribution of microtubule-associated proteins and beta-tubulin isotypes. J Neurochem. 51 (6), 1825-1838 (1988).
  21. Arnhold, S., Klein, H., Semkova, I., Addicks, K., Schraermeyer, U. Neurally selected embryonic stem cells induce tumor formation after long-term survival following engraftment into the subretinal space. Invest Ophthalmol Vis Sci. 45 (12), 4251-4255 (2004).
  22. Liu, Y., et al. Retinoic acid receptor beta mediates the growth-inhibitory effect of retinoic acid by promoting apoptosis in human breast cancer cells. Mol Cell Biol. 16 (3), 1138-1149 (1996).
  23. Altucci, L., et al. Retinoic acid-induced apoptosis in leukemia cells is mediated by paracrine action of tumor-selective death ligand TRAIL. Nat Med. 7 (6), 680-686 (2001).
  24. Pettersson, F., Dalgleish, A. G., Bissonnette, R. P., Colston, K. W. Retinoids cause apoptosis in pancreatic cancer cells via activation of RAR-gamma and altered expression of Bcl-2/Bax. Br J Cancer. 87 (5), 555-561 (2002).
  25. Kothapalli, C. R., Kamm, R. D. 3D matrix microenvironment for targeted differentiation of embryonic stem cells into neural and glial lineages. Biomaterials. 34 (25), 5995-6007 (2013).
  26. Cai, J., et al. BMP and TGF-beta pathway mediators are critical upstream regulators of Wnt signaling during midbrain dopamine differentiation in human pluripotent stem cells. Dev Biol. 376 (1), 62-73 (2013).

Play Video

Cite This Article
Yang, J., Wu, C., Stefanescu, I., Horowitz, A. Analysis of Retinoic Acid-induced Neural Differentiation of Mouse Embryonic Stem Cells in Two and Three-dimensional Embryoid Bodies. J. Vis. Exp. (122), e55621, doi:10.3791/55621 (2017).

View Video