Изоляция, характеристика и очистки макрофагов из пострадавших от связанных с ожирением воспаление тканей

Мышь модели широко используются для изучения динамики заболеваний человека. Надлежащая изоляция резидентов клеток ткани от мышей в состоянии больной может обеспечить платформу для понимания молекулярная и клеточная вклад в патогенезе заболевания¹. Одно расстройство, которое имеет решающее значение является ожирение. Распространенность ожирения продолжает расти во всем мире параллельно с сопротивлением инсулина и типа 2 диабет, сердечно-сосудистых заболеваний и жировой болезни печени^2,3. Чрезмерное потребление питательных веществ далее перекос, снижение физической активности, вызывая изменения сигналов, вытекающих из жировой ткани, который может изменить клеточного окружения других периферийных тканей, таких как аорты и печени⁴. Такие нарушения метаболизма гомеостаза приводит к хронической низкосортных внутрирастительного воспаления⁵.

Классическая активация макрофагов, резидент в аорту и печени, а также их вербовки в белой жировой ткани (Ват) было показано не только инициировать регуляции метаболических сигналов, но также поддерживать воспаление^6,7. Фенотипические и функциональных неоднородность макрофагов прочно ассоциируется с патогенезе ожирения связаны сопутствующие заболевания⁷. Динамический пластичности в макрофагов поляризации позволяет эти клетки демонстрируют широкий спектр активированные фенотипов, которые координируют прогрессии и резолюции воспаления⁸. В то время как классически Активированные макрофаги (M1) вовлечены в распространении воспаления, альтернативно Активированные макрофаги (м2) были связаны с резолюцией и ткани ремонт^9,10.

Как тело испытывает метаболический стресс, аномально накапливается белой жировой ткани. Расширенный жировой ткани привлекает и удерживает воспалительные клетки, которые глубоко изменить функции нормальной Адипоцит содействовать сопротивление инсулина, гипергликемия и в конечном итоге сахарный диабет типа 2, сопротивление инсулина или гипергликемия^{11, 12}. Параллельно белой жировой ткани переделывает в ответ на воспалительные сигналы, выпущенное проникли классически активированные (M1) жировой ткани макрофагами (банкоматов)^13,14. Этот многоклеточной орган оказывает Каскад сигналов, derails нормальной функции других органов тела, например, аорта и печени⁴.

Печень является метаболически электростанция, которая адаптируется в ответ на раздражители, происходящих из близлежащих dysregulated Ват¹⁵. Макрофагами печени или клеток Купфера, в ответ на метаболические изменения, выделяют воспалительных цитокинов, что преобразования как Паренхиматозный и фенотип не Паренхиматозный клеток и содействовать тканей ремоделирования. Накопление липидов в печени, воспаление, депозиты чрезмерно внеклеточного матрикса, некроз и возможные функции потерь следует воспалительных оскорбления, предоставляющих широкий спектр повреждения печени, связанные с безалкогольных жирная болезнь печени ^16,17,18.

Параллельно с нарушенной Ват и функции печени крупные артерии накапливаться липидов в стенке артерий, как тело испытывает хронический метаболический стресс¹⁹. Накопление липидов артериальной вызывает секрецию chemokines активированный эндотелиальных клеток и последующего набора моноциты²⁰. После вербовки, моноциты размножаться, дифференцировать, глотать липопротеинов и стать пены клетки. Атерогенеза инициируется и устойчивого про воспалительных деятельности набранных и тканевых макрофагов резидентов липидов Ладена. Поддаваясь внеклеточные и внутриклеточных стресс сигналы передаются в этом атерогенные микроокружения, эти макрофаги затем заниматься apoptotic сигнальный Каскад. Как эти пены клетки умирают, они способствуют их содержание липидов заполнены на ядро некротические поражения, которое затем приводит к разрыву зубного налета, инфаркта миокарда и инсульта.

Коллективно неоднородность фенотипов макрофагов в части оркеструет ожирения, вызванных воспалительные изменения, наблюдаемые в dysregulated ткани, такие как Ват, печень и аорты^8,21. Характеристику набранных и ткани-резидентов макрофаги могут обеспечить понимание потенциальных молекулярных целей, которые манипулируют макрофагов фенотип¹. Эффективно охарактеризовать макрофаги от ожирения индуцированной воспаленных тканей, подвески одной ячейки можно получить путем ферментативного пищеварения. Такие протоколы диссоциации должна быть эффективной в достаточно унижающего достоинство соединительной ткани при минимизации иммунных клеток смерть и обеспечивая оптимальное ячейки урожайности. Смесь ферментов зависит от типа ткани и ее структурных составляющих. Эластичных тканей, таких как аорты требует сильнее ферментативную активность, по сравнению с печени и Ват, для достижения ткани диссоциации. От одноклеточного подвеска резидентов макрофаги ткани может быть однозначно характеризуется или изолированные для дополнительного течению анализа, таких как транскрипционный анализ профиля.

Здесь ткани конкретного протокол описан, использующий коллагеназы зависимых тканей пищеварение и полихромный проточной цитометрии эффективно изолировать и характеризуют ткани резидентов макрофаги, полученные от традиционного рациона индуцированной ожирения, атеросклероз, простой стеатоз и стеатогепатит мыши модели. Одновременная окрашивания клеток поверхности маркеров с антителами против лейкоцита-(CD45 или CD11b) и макрофагов – специфических антигенов (F4/80), часто используется для идентификации макрофагов населения²². Активирован флуоресценции клеток, сортируя (FACS) является мощной стратегией, используемый для сортировки этих выявленных подвергающегося высокой чистоты. Отсортированный населения можно затем оценить фенотип профилей конкретных генов с помощью течению молекулярного анализа (например, количественные реального времени полимеразной цепной реакции)²³. Хотя стандартные проточной цитометрии и сортировки потока на основе цитометрии клеток являются мощными инструментами в отличительный макрофагов в суспензии значительно гетерогенных клеток, бывший протоколы должны быть оптимизированы для обеспечения успешного вывода. В этом исследовании описываются протоколы, которые эффективно изолировать и характеризуют конкретные жизнеспособных тканевых макрофагов; что еще более важно это исследование обеспечивает решающую понимание технических вопросов, которые часто возникают, а также активную и неисправностей стратегии предотвращения и/или их решения.