عزل وتوصيف وتنقية الضامة من الأنسجة المتضررة من التهاب المتصلة بالسمنة
Summary
يسمح هذا البروتوكول باحث لعزل وتوصيف المقيم في الأنسجة الضامة في مختلف الأنسجة الملتهبة المستخرجة من نماذج الناجمة عن النظام الغذائي للاضطرابات الأيضية السمة المميزة.
Abstract
السمنة تعزز دولة التهابات مزمنة التي هي إلى حد كبير بوساطة المقيم في الأنسجة الضامة، فضلا عن الوحيدات المستمدة الضامة. السمنة الناجمة عن النظام الغذائي (ديو) نموذج قيمة في دراسة دور تغاير سنخية؛ بلعم كافية العزلة غير صعبة للحصول من الأنسجة الملتهبة. في هذا البروتوكول، نحن الخطوط العريضة للخطوات العزلة والمبادئ التوجيهية اللازمة استكشاف الأخطاء وإصلاحها المستمدة من دراساتنا للحصول على عدد مناسب من مقيم في الأنسجة الضامة من الفئران بعد 18 أسبوعا من الدهون (HFD) أو (الدهون عالية/الكوليسترول العالية التدخل الغذائي هفهكد). ويركز هذا البروتوكول على أنسجة مميزة ثلاث دراسة السمنة وتصلب الشرايين، بما في ذلك الكبد، والأنسجة الدهنية البيضاء (وات)، والشريان الاورطي. نسلط الضوء على الاستخدام المزدوج كيف التدفق الخلوي يمكن تحقيق بعدا جديداً لعزل وتوصيف المقيم في الأنسجة الضامة. قسم أساسي من هذا البروتوكول يتناول التعقيدات الكامنة وراء ديجيسشنز الانزيمية الخاصة بالانسجة والعزلة بلعم، وجسم سطح الخلية اللاحقة تلطيخ لتحليل تدفق سيتوميتريك. هذا البروتوكول يتناول التعقيدات القائمة الأساسية لخلية تنشيط الفلورسنت الفرز (نظام مراقبة الأصول الميدانية)، ويقدم إيضاحات لهذه التعقيدات بغية الحصول على توصيف مجموعة واسعة من السكان خلية تم فرزها على نحو كاف. وترد أساليب الإثراء بديل لفرز الخلايا، مثل الكبد كثيفة، والسماح لإدارة الوقت والمرونة عند العمل مع نظام مراقبة الأصول الميدانية. باختصار، هذا البروتوكول الإيدز الباحث لتقييم التغايرية بلعم من العديد من الأنسجة الملتهبة في دراسة معينة ويوفر تلميحات استكشاف الأخطاء وإصلاحها الثاقبة التي نجحت لعزل الخلوية مواتية وتوصيف للحصول على الخلايا المناعية في التهاب ديو بوساطة.
Introduction
نماذج الماوس قد استخدمت على نطاق واسع لدراسة القوى المحركة للأمراض التي تصيب الإنسان. العزل السليم من خلايا الأنسجة المقيمين من الفئران في حالة مريضة يمكن أن توفر منطلقاً لفهم المساهمات الجزيئية والخلوية للآلية المرضية ل المرض1. اضطراب واحد له أهمية حاسمة هو السمنة. الإصابة بالسمنة وتواصل الارتفاع في جميع أنحاء العالم بالتوازي مع مقاومة الأنسولين واكتب 2 مرض البول السكري، وأمراض القلب والأوعية الدموية، ومرض الكبد الدهني2،3. استهلاك المواد الغذائية المفرطة كذلك ينحرف بانخفاض النشاط البدني أحداث تغيير الإشارات الصادرة من الأنسجة الدهنية، والتي يمكن أن يغير الوسط الخلوية للأنسجة المحيطية الأخرى مثل الشريان الاورطي والكبد4. ويؤدي مثل هذا الإخلال بالتوازن الأيضي الالتهابات الجهازية مزمنة منخفضة درجة5.
ثبت ليس فقط بدء التقلبات إشارات الأيضية ولكن أيضا إدامة التهاب6،7الكلاسيكية تفعيل الضامة المقيم للشريان الاورطي والكبد، فضلا عن تجنيدهم للأنسجة الدهنية البيضاء (وات). عدم تجانس المظهرية والوظيفية من الضامة يرتبط ارتباطاً قويا بأمراض السمنة المتصلة المراضات المشارك7. اللدونة دينامية في الاستقطاب بلعم يسمح لهذه الخلايا للمعرض مجموعة واسعة من تنشيط تعمل بتنسيق التقدم والقرار من التهاب8. بينما تقليديا تنشيط الضامة (M1) متورطة في انتشار التهاب، بدلاً من تنشيط الضامة (M2) ارتبطت بالقرار والأنسجة وإصلاح9،10.
كما يخضع الجسم للإجهاد الأيضي، تتراكم الأنسجة الدهنية البيضاء انخفاضا غير عادي. الأنسجة الدهنية الموسعة يجذب ويحتفظ بالخلايا التحريضية التي تغير عميق الدالة adipocyte العادية لتعزيز مقاومة الأنسولين وارتفاع السكر في الدم وفي نهاية المطاف نوع 2 السكري ومقاومة الأنسولين أو، فرط سكر الدم11 12. في موازاة ذلك، تسلل يعيد تشكيل الأنسجة الدهنية البيضاء استجابة لإشارات التحريضية الصادرة عن المنشط كلاسيكي (M1) الأنسجة الدهنية، الضامة (Atm)13،14. وتمارس هذه الهيئة متعددة الخلايا سلسلة إشارات أن يحرف وظيفة طبيعية لأعضاء الجسم الأخرى مثل الشريان الاورطي و الكبد4.
الكبد هو قوة الأيض التي تكيف في الاستجابة للمحفزات التي تنشأ من قريب dysregulated وات15. الضامة الكبد أو خلايا كوبفر، استجابة للتغيرات الاستقلابية، إفراز السيتوكينات الالتهابية التي تحول كل متني والنمط الظاهري الخلية غير متني وتشجيع إعادة عرض النسيج. تراكم الدهون الكبدية والتهاب ورواسب المصفوفة خارج الخلية المفرط، ونخر ويتبع فقدان وظيفة في نهاية المطاف الشتائم التحريضية المساهمة في طائفة واسعة من تلف في الكبد المرتبطة بمرض الكبد الدهني غير الكحولية 16،،من1718.
وبالتوازي مع الشبهة وات ووظيفة الكبد، الشرايين الكبيرة تتراكم الدهون داخل الجدار الشرياني كما يخضع الجسم للإجهاد الأيضي المزمنة19. مشغلات تراكم الدهن الشرياني إفراز المستقطبات بتنشيط خلايا بطانية والتعيين اللاحق وحيدات20. بمجرد تعيينهم، وحيدات تتكاثر والتفريق، واستيعاب البروتينات الدهنية وتصبح خلايا الرغاوي. بدأت أثيروجينيسيس ولحقت بنشاط برو التحريضية المعينين والأنسجة الضامة محملة بالدهن المقيم. الخضوع لإشارات الإجهاد خارج الخلية وداخل الخلية في هذا المكروية atherogenic، هذه الضامة ثم الانخراط في أبوبتوتيك إشارات تتالي. كما يموت هذه الخلايا الرغوية، وهم يساهمون محتوياتها الدهن شغلها في الصميم نخرية الآفة، مما يؤدي بعد ذلك إلى تمزق اللوحة واحتشاء عضلة القلب والسكتة الدماغية.
جماعياً، ينظم عدم تجانس بلعم تعمل جزئيا السمنة الناجمة عن التغيرات التحريضية التي لوحظت في أنسجة dysregulated مثل وات والكبد والشريان الاورطي8،21. توصيف للمعينين والأنسجة الضامة المقيمين يمكن أن توفر نظرة ثاقبة الأهداف الجزيئية المحتملة التي تعالج بلعم النمط الظاهري1. لوصف فعالية الضامة من الأنسجة الملتهبة الناجمة عن السمنة، يمكن الحصول على تعليق خلية واحدة من خلال الهضم الأنزيمي. يجب أن تكون هذه البروتوكولات تفارق فعالة في تدهور النسيج الضام بما فيه الكفاية مع الحد من موت الخلايا المناعية وتوفير العائد الأمثل الخلية. مزيج الإنزيم يعتمد على نوع النسيج ويشكلون الهيكلية. يتطلب مرونة الأنسجة مثل الشريان الاورطي النشاط الأنزيمي أقوى، بالمقارنة مع الكبد ووات، لتحقيق الانفصال من الأنسجة. من تعليق خلية مفردة، يمكن لبس تتميز الأنسجة الضامة المقيم أو معزولة لمزيد من التحليلات المصب مثل التنميط النسخي.
هنا هو وصف بروتوكول الخاصة بالانسجة يستخدم الهضم الأنسجة تعتمد على كولاجيناز ومجسماته التدفق الخلوي لعزل وتوصيف المقيم في الأنسجة الضامة التي تم الحصول عليها من النظام الغذائي التقليدية الناجمة عن السمنة، بفعالية تصلب الشرايين وذلك بسيط ونماذج الماوس steatohepatitis. متزامنة تلطيخ علامات الخلية السطحية مع الأجسام المضادة ضد الكريات البيض-(CD45 و/أو CD11b) وبلعم-يستخدم لتحديد السكان بلعم22غالباً المستضدات محددة (F4/80). خلية تنشيط fluorescence الفرز (نظام مراقبة الأصول الميدانية) استراتيجية قوية ويستخدم لفرز هذه المجموعات السكانية التي تم تحديدها في درجة نقاء عالية. ثم يمكن تقييم السكان تم فرزها لملامح الجينات محددة النمط الظاهري باستخدام التحليل الجزيئي المتلقين للمعلومات (مثل كمية الوقت الحقيقي تفاعل البوليميراز المتسلسل)23. على الرغم من أن معيار التدفق الخلوي والتدفق الخلوي تقوم الخلية الفرز أدوات قوية في تمييز الضامة ضمن تعليق خلية غير متجانسة إلى حد كبير، يجب أن يكون الأمثل البروتوكولات السابقة لضمان نجاح الإخراج. ويرد في هذه الدراسة، والبروتوكولات التي عزل بفعالية وتميز الضامة محددة الأنسجة قابلة للتطبيق؛ الأهم من ذلك، توفر هذه الدراسة حاسمة من التبصر في المسائل الفنية التي كثيرا ما تنشأ، فضلا عن استراتيجيات استباقية ومبسطة لحل المشاكل منع و/أو حلها.
Protocol
Representative Results
Discussion
نماذج اضطراب التمثيل الغذائي الناجمة عن النظام الغذائي التي تحاكي المراضات المشاركة مثل تصلب الشرايين، وذلك بسيطة، steatohepatitis، والسكري من النوع 2 تستخدم على نطاق واسع لتحسين فهم الآليات الجزيئية الكامنة وراء تطور المرض. كولاجيناز يتوقف الهضم يستخدم غالباً لننأى بالانسجة لتحرير الخلايا من…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
نود أن نشكر “التدفق الخلوي المرفق الأساسية” في “جامعة بنسلفانيا الدولة الألفية العلوم المعقدة”.
Materials
| 26G x 5/8 in Needles | BD | 305115 | |
| 23G x 0.75 in needle x 12 in. tubing Blood Collection Set | BD | 367297 | Used for cannulation of subhepatic IVC during liver perfusion |
| 21G 1 1/2 in. Needles | BD | 305156 | |
| 1mL syringe with rubber stops | BD | 309659 | |
| 10mL Syringes | BD | 309604 | |
| 1mL Syringe | BD | 309659 | |
| F4/80 PE | Biolegend | 123110 | |
| CD11c PE/Cy7 | Biolegend | 117318 | |
| CD11b PE/Cy5 | eBioscience | 15-0112-81 | |
| Anti-mouse CD16/32 Fc Block | Biolegend | 101320 | |
| CD45 Pacific Blue | Biolegend | 103126 | |
| PE Rat IgG2a | Biolegend | 400508 | |
| PE/Cy7 Armenian Hamster IgG | Biolegend | 400922 | |
| PE/Cy5 Rat IgG2b | Biolegend | 400610 | |
| Pacific Blue Rat IgG2c | Biolegend | 400717 | |
| Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM) | Cellgro | 15-017-CV | |
| 1X Phosphate Buffered Saline (PBS) | Cellgro | 21-031-CV | |
| 70 micron cell strainers | Corning, Inc. | 352350 | |
| 1.7 mL microcentrifuge tube | Denville | C2170 | |
| Paraformaldehyde Aqueous Solution -16X | Electron Microscopy Sciences | CAS #30525-89-4 | |
| Micro Dissecting Scissors, 3.5 inch, Straight, 23mm, Sharp | Stoelting | 52132-10P | Used for general dissecting purposes |
| Micro Forceps, 4in, full curve, 0.8mm | Stoelting | 52102-37P | Used for general dissecting purposes |
| Spring dissection scissors – 3 mm Cutting edge | Fine Science Tool | 15000-10 | Used for aorta dissection Steps 1.3.3.17 to 1.3.3.28 |
| Curved 0.07 x 0.04 mm Tip Forceps | Fine Science Tool | 11297-10 | Used for aorta dissection Steps 1.3.3.17 to 1.3.3.28 |
| Hemostatic Forceps (Curved) | Fine Science Tool | 13021-12 | |
| Heparin Sodium Salt | Fischer Scientific | 9041-08-1 | |
| 35mm Cell Culture/Petri Dishes | Fischer Scientific | 12-565-90 | |
| Polystyrene Petri Dishes (10 cm) w/lid | Fischer Scientific | 08-757-100D | |
| 15mL Conical Centrifuge Tubes (Polypropylene) | Fischer Scientific | 14-959-53A | |
| 50mL Conical Centrifuge Tubes (Polypropylene) | Fischer Scientific | 14-432-22 | |
| 5mL Round-Bottom Polystyrene Tubes | Fischer Scientific | 14-959-5 | |
| Fetal Bovine Serum | Gemini Bio-Products | 100-106 | |
| Ethanol (Stock Ethyl Alcohol Denatured, Anyhydrous) | Millipore | EX0285-1 | |
| Bovine Serum Albumin | Rockland | BSA-50 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H3375 | |
| Collagenase Type II | Sigma-Aldrich | C6885 | |
| Collagenasse Type XI | Sigma-Aldrich | C7657 | |
| Hyaluronidase Type I | Sigma-Aldrich | H3506 | |
| DNAse | Sigma-Aldrich | DN25 | |
| Collagenase Type I | Sigma-Aldrich | C0130 | |
| NaOH | Sigma Aldrich | 1310-73-2 | |
| CaCl2 | Sigma Aldrich | 449709-10G | |
| 500mL beaker | Sigma Aldrich | 02-540M | |
| 4 cm Hemostatic clamp | Stoelting | 52120-40 | |
| Toothed forceps | Stoelting | 52104-33P | |
| 50 micron Disposable filters | Systemex | 04-0042-2317 | |
| Collagenase Type IV | ThermoFischer Scientific | 17104019 | |
| Ammonium Chloride Potassium (ACK) | ThermoFischer Scientific | A1049201 | |
| Razors (0.22 mm (0.009")) | VWR International | 55411-050 | |
| Texas Red Live/Dead stain | Red viability stain (in Figure 1A) |
References
- Davies, L. C., Taylor, P. R. Tissue-resident macrophages: Then and Now. Immunology. 144 (4), 541-548 (2015).
- Kahn, S. E., Hull, R. L., Utzschneider, K. M. Mechanisms linking obesity to insulin resistance and type 2 diabetes. Nature. 444 (12), 840-846 (2006).
- Van Gaal, L. F., Mertens, I. L., De Block, C. E. Mechanisms linking obesity with cardiovascular disease. Nature. 444 (12), 875-880 (2006).
- Jung, U., Choi, M. -. S. Obesity and Its Metabolic Complications: The Role of Adipokines and the Relationship between Obesity, Inflammation, Insulin Resistance, Dyslipidemia and Nonalcoholic Fatty Liver Disease. Int J Mol Sci. 15 (4), 6184-6223 (2014).
- Emanuela, F., Grazia, M., Marco, D. R., Maria Paola, L., Giorgio, F., Marco, B. Inflammation as a link between obesity and metabolic syndrome. Nutr Metab. 2012, 1-7 (2012).
- Vieira-Potter, V. J. Inflammation and macrophage modulation in adipose tissues. Cell Microbiol. 16 (10), 1484-1492 (2014).
- Chawla, A., Nguyen, K. D., Goh, Y. P. S. Macrophage-mediated inflammation in metabolic disease. Nat Rev Immunol. 11 (11), 738-749 (2011).
- Dey, A., Allen, J., Hankey-giblin, P. A. Ontogeny and polarization of macrophages in inflammation : blood monocytes versus tissue macrophages. Front Immunol. 5 (1), 1-15 (2015).
- Mills, C. D., Lenz, L. L., Ley, K. Macrophages at the fork in the road to health or disease. Front Immunol. 6 (2), 1-6 (2015).
- Italiani, P., Boraschi, D. From monocytes to M1/M2 macrophages: Phenotypical vs. functional differentiation. Front Immunol. 5 (8), 1-22 (2014).
- Guilherme, A., Virbasius, J. V., Vishwajeet, P., Czech, M. P. Adipocyte dysfunctions linking obesity to insulin resistance and type 2 diabetes. Nat Rev Mol Cell Biol. 9 (5), 367-377 (2008).
- Cummins, T. D., Holden, C. R., et al. Metabolic remodeling of white adipose tissue in obesity. Am J Physiol Endocrinol Metab. 307 (3), 262-277 (2014).
- Fujisaka, S., Usui, I., et al. Regulatory Mechanisms for Adipose Tissue M1 and M2 Macrophages in Diet Induced Obese Mice. Diabetes. 58 (9), 2574-2582 (2009).
- Lumeng, C. N., Bodzin, J. L., Saltiel, A. R. Obesity induces a phenotipic switch in adipose tissue macrophage polarization. J Clin Invest. 117 (1), 175-184 (2007).
- Qureshi, K., Abrams, G. A. Metabolic liver disease of obesity and role of adipose tissue in the pathogenesis of nonalcoholic fatty liver disease. World J Gastroenterol. 13 (26), 3540-3553 (2007).
- Bedossa, P., Paradis, V. Liver extracellular matrix in health and disease. J Pathol. 200 (4), 504-515 (2003).
- Tilg, H., Moschen, A. R. Evolution of inflammation in nonalcoholic fatty liver disease: The multiple parallel hits hypothesis. Hepatology. 52 (5), 1836-1846 (2010).
- Milic, S., Lulic, D., Stimac, D. Non-alcoholic fatty liver disease and obesity: Biochemical, metabolic and clinical presentations. World J Gastroenterol. 20 (28), 9330-9337 (2014).
- Williams, I. L., Wheatcroft, S. B., Shah, A. M., Kearney, M. T. Obesity, atherosclerosis and the vascular endothelium: mechanisms of reduced nitric oxide bioavailability in obese humans. Int J Obesity. 26 (12), 754-764 (2002).
- Mestas, J., Ley, K. Monocyte-Endothelial Cell Interactions in the Development of Atherosclerosis. Trends Cardiovasc Med. 18 (6), 228-232 (2008).
- Wynn, T. A., Chawla, A., Pollard, J. W. Macrophage biology in development, homeostasis and disease. Nature. 496 (7446), 445-455 (2013).
- Davies, L. C., Jenkins, S. J., Allen, J. E., Taylor, P. R. Tissue-resident macrophages. Nat Rev Immunol. 14 (10), 986-995 (2013).
- Basu, S., Campbell, H. M., Dittel, B. N., Ray, A. Purification of specific cell population by fluorescence activated cell sorting (FACS). J Vis Exp. (41), e1546 (2010).
- Mann, A., Thompson, A., Robbins, N., Blomkalns, A. L. Localization, Identification, and Excision of Murine Adipose Depots. J Vis Exp. (94), e52174 (2014).
- Butcher, M. J., Herre, M., Ley, K., Galkina, E. Flow cytometry analysis of immune cells within murine aortas. J Vis Exp. (53), e2848 (2011).
- Salamone, M., Saladino, S., Pampalone, M. Tissue Dissociation and Primary Cells Isolation Using Recombinant Collagenases Class I and II. Chemical Engineering Transactions. 38, 247-252 (2014).
- Wells, R. G. The role of matrix stiffness in regulating cell behavior. Hepatology. 47 (4), 1394-1400 (2008).
- Fain, J. N. Isolation of Free Brown and White Fat Cells. Diabetologia. 375 (1964), 555-561 (1968).
- Seglen, P. Preparation of isolated rat liver cells. Method Cell Biol. 13, 29-83 (1976).
- Yu, S., Allen, J. N., et al. The Ron Receptor Tyrosine Kinase Regulates Macrophage Heterogeneity and Plays a Protective Role in Diet-Induced Obesity, Atherosclerosis, and Hepatosteatosis. J Immunol. 197 (1), 256-265 (2016).
- Yu, Y. R. A., O’Koren, E. G., et al. A protocol for the comprehensive flow cytometric analysis of immune cells in normal and inflamed murine non-lymphoid tissues. PLoS ONE. 11 (3), 1-23 (2016).
- Zizzo, G., Hilliard, B. A., Monestier, M., Cohen, P. L. Efficient clearance of early apoptotic cells by human macrophages requires "M2c" polarization and MerTK induction. J Immunol. 100 (2), 130-134 (2012).
- Jablonski, K. A., Amici, S. A., et al. Novel markers to delineate murine M1 and M2 macrophages. PLoS ONE. 10 (12), 5-11 (2015).
- Rőszer, T. Understanding the Mysterious M2 Macrophage through Activation Markers and Effector Mechanisms. Mediators of Inflamm. 2015, 1-16 (2015).
- Cho, K. W., Morris, D. L., Lumeng, C. N. Flow Cytometry Analysis of Adipose Tissue Macrophages. Methods Enzymol. 4 (164), 297-314 (2011).
- Kim, Y. -. J., Brox, T., Feiden, W., Weickert, J. Technical Note: Flow Cytometry Controls, Instrument Setup, and the Determination of Positivity. Cytometry A. 71 (1), 8-15 (2007).
- Tung, J. W., Heydari, K., et al. Modern Flow Cytometry: A Practical Approach. Clin Lab Med. 27 (3), 453-468 (2007).
- Martinez, F. O., Gordon, S. The M1 and M2 paradigm of macrophage activation: time for reassessment. F1000. 6 (3), 13 (2014).
- Porcheray, F., Viaud, S., et al. Macrophage activation switching: An asset for the resolution of inflammation. Clin Exp Immunol. 142 (3), 481-489 (2005).
- Plouffe, B. D., Murthy, S. K., Lewis, L. H. Fundamentals and Application of Magnetic Particles in Cell Isolation and Enrichment. Rep Prog Phys. 1 (78), 1-6 (2010).
